A P elem technikák: génmanipuláció tetszés szerint

Az előadások a következő témára: "A P elem technikák: génmanipuláció tetszés szerint"— Előadás másolata:

1 A P elem technikák: génmanipuláció tetszés szerint
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: génmanipuláció tetszés szerint

2 Irányított génmanipuláció
Az irányított génmanipuláció célja egy endogén gén módosítása vagy cseréje egy bevitt szekvenciára. A bevitt szekvencia meghatározott helyeken hordoz olyan célzott mutációkat, amelyek elrontják, vagy megváltoztatják az érintett gén funkcióját. Irányított géncsere általánosan használt az élesztő és egér genetikában. Lineáris DNS-t juttatnak be a sejtekbe, amit a sejtek rekombinációs gépezete integrál a kromoszómákba általában a bevitt szekvencia és az ennek megfelelő endogén gén közötti homológ rekombinációval. A módszer kritikus lépése a lineáris DNS hatékony bejuttatása a sejtekbe. Élesztőkben hatékony transzformálással, egérben pedig embrionális őssejtek elektroporálásával érik ezt el. Drosophilában egyik módszer sem működik, ezért Rong és Golic egy új eljárást dolgozott ki, aminek lényege, hogy a rekombinációt indukáló lineáris DNS-t a sejtekben hozzák létre in vivo.

3 Az irányított génmanipuláció kidolgozói Drosophilában
Yikang Rong Kent Golic

4 A génmanipulációs donor konstrukció felépítése
FRT I-CreI I-SceI white + Flp transzformálás donor Hordozza a célgénnek megfelelő módosított (mutáns) szekvenciát Tartalmazza a CreI és SceI meganukleázok felismerő szekvenciáit Tartalmaz két tandem Flp helyspecifikus rekombináz felismerő helyet Hordozza a mini-white marker gént

5 Az irányított génmanipuláció mechanizmusa - 1
FRT I-CreI I-SceI FRT white donor transzformálás 1. A donor konstrukció bejuttatása a Drosophila genomba 2. Az Flp rekombináz extra-kromoszómális kör alakú DNS molekulát hoz létre Flp +

6 Az irányított génmanipuláció mechanizmusa - 2
3. A SceI endonukleáz egy kettősszálú törést hoz létre a kör alakú donor molekulában 4. Rekombináció játszódik le a lineáris donor szekvencia és a vele homológ célgén között, ami egy duplikációt eredményez 5. CreI endonukleáz hasítás egy második homológ rekombinációs eseményt indukál a duplikálódott szekvenciák között 6. A duplikáció megszűnik, és a célgén mutáns allélja tanulmányozható X célgén I-CreI CreI indukció

7 A single stranded annealing (SSA) folyamata
SSA akkor indukálódik, amikor kettősszálú törés jön létre két tandem duplikálódó DNS szekvencia között 1. Az ismétlődő szekvenciákra is kiterjedő egyszálú DNS szekvencia képződik 2. A komplementer szekvenciák kapcsolódnak egymáshoz 3. A nem párosodó végek emésztése és az egyszálú hézagok feltöltése után megszűnik a duplikáció, és eliminálódik a duplikációk közötti szekvencia

8 A homológ rekombináció típusai
ends-in ends-out