ATP (Adenozin-trifoszfát) meghatározása talajban - kénsavas, foszfátos extrakciós eljárással Tóth Anna Szilvia.

Az előadások a következő témára: "ATP (Adenozin-trifoszfát) meghatározása talajban - kénsavas, foszfátos extrakciós eljárással Tóth Anna Szilvia."— Előadás másolata:

1 ATP (Adenozin-trifoszfát) meghatározása talajban - kénsavas, foszfátos extrakciós eljárással
Tóth Anna Szilvia

2 ATP meghatározása talajokban
Minden élő sejtben megtalálható, koenzimként és szubsztrátként funkcionál. Ezen tulajdonságai miatt az ATP alkalmas paraméter a talajban jelen lévő folyamatok és mikrobiális tevékenységek illetve biomassza mennyiség becslésére. Az ATP talajból extrakcióval kinyerhető, és biolumineszcenciával meghatározható a mennyisége.

3 Meghatározás biolumineszcenciával
A biolumineszcencia enzimkatalizált reakció, amely során fényemisszió történik. A luciferáz enzim katalizálja a D-luciferin aktiválását ATP-vel, és a későbbi oxidációját az elektromosan gerjesztett oxiluciferinné. Az oxiluciferin eredeti állapotába történő visszatérését fény kibocsátás kíséri. A meghatározási mód nagy érzékenységű, és igen alacsony, M –es koncentrációk detektálására is alkalmas. A jobb oldali képen: biolumineszcencia jelensége a természetben

4 Meghatározás HPLC-val
A luciferin-luciferáz rendszer mellett, az ATP meghatározása HPLC (Folyadékkromatográfiás) módszerrel is történhet. Ezen technológia alkalmazása még ritka, a relatíve hosszú mérési idő, és a drága berendezés miatt. Az ATP meghatározásnál jelentős előny a luciferin-luciferáz teszt rendszer nagy érzékenysége.

5 Meghatározáskor felmerülő problémák
A luciferin-luciferáz teszt rendszer esetén problémát jelenthet az ATP mennyiségi meghatározása talajokból. Ennek főbb okai: Egyes anyagoknál inhibítor hatás(pl. nitrát, magnézium-, kalcium-, klorid-, bromid- ionok és huminsavak esetében) , amely további problémát jelent a luciferáz aktivitásra nézve. Sok ion (pl. Fe(III) ion) komplexeket képez az ATP-vel, így megakadályozzák a megbízható meghatározást. az ATP nem csak mikróbákból extrahálható, hanem növények gyökeréből és állati sejtekből egyaránt. Ez zavarja a mikrobiális folyamatok azonosítását.

6 A meghatározás elve A módszer ATP kénsav és foszfát oldattal való extrakcióján alapul. Majd ezután az ATP meghatározását a luciferin-luciferáz teszt rendszer segítségével végzik NRB jelenlétében. Az ábrán a luciferin-luciferáz reakció:

7 Anyagok és berendezések
Luminométer és küvetták Jégfürdő Műanyag kémcsövek (77*22 mm) További anyagok (ld. TCA módszer) Kémiai anyagok és reagensek „A” puffer: Tris ((HOCH2)3CNH2 –2-Amino-2-hidroximetil-propán-1,3- diol - 250mM, és – EDTA (Etilén-diamin-tetraacetát) - 4mM oldat „B” puffer:„A” puffer 10-szeres hígításban, majd autoklávban sterilizálva. „A” extrahálószer: H2SO4 - re nézve 0,5 M, Na2HPO4 –re nézve 0,25 M oldat „B” extrahálószer: Lehet NRB (Lumac), vagy a „B” pufferben oldott 10%-os rodalon. Luciferin-luciferáz (Lumit) Standard ATP oldatok 

8 A meghatározás lépései
ATP extrakciója: Az extrakciót az „A” extrahálószerrel végezzük, az előzőleg előkészített standard, vak és a mérendő talajmintákon. A művelet során a szuszpenziókat 15 percig rázatjuk, majd 20 percig, 121 C-on sterilizáljuk. ATP mérése: A lehűtött (vak, standard, és viszsgálandó) mintákat felrázzuk, majd a homogén szuszpenziókat 1,5 ml „A” pufferhez adjuk. Ezután megint összerázzuk, és a mintához adagolunk 50 mikrolitert az NRB extrahálószerből. A küvettát luminométerbe helyezzük. 100 mikrolitert injektálunk a luciferin-luciferáz enzimekből. 0-30 sec integrációs periódus után mérjük az ATP tartalmat.

9 Kiértékelés és kalibrációs görbe felvétele
A standard kalibrációs görbe felvétele úgy történik, hogy talajmintákhoz különböző ATP koncentrációkat adunk, amelyeket aztán úgy kezelünk mint a vizsgálandó mintákat. A talajok ATP tartalmát a standard kalibrációs görbéről olvassuk le, mikrogramm ATP/ g száraz talajtömeg – mértékegységben. Az ATP kimutatás %-a = (A+B) – (A) *100 / C-D Ahol A a minta ATP-je, B a standard ATP, C az extraktumban mért standard ATP, D a vak minta.

10 Felhasznált irodalom Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995

11 Köszönöm a figyelmet!