2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények.

Az előadások a következő témára: "2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények."— Előadás másolata:

1 2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények MTA MGKI Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények MTA MGKI

2 2009. november 26. Mintavétel Szállítás, tárolás RNS kivonás cDNS átírás Real-time PCR Kiértékelés

3 2009. november 26. Mintavétel és tárolás Meghatározott szervek és fenofázisok Nehézségek pollengyűjtésnél RNAlater, szárazjég — -70°C

4 2009. november 26. RNS kivonás Összes RNS típus kivonása (rRNS referencia) Nehézségek mag esetében Tisztaság és gyorsaság

5 2009. november 26. Reverz transzkripció A kivont RNS-ről random hexamer primerek és reverz transzkriptáz segítségével DNS másolatot készítünk rRNS-t és mRNS-t is átírjuk – referencia- és célgén Higítások

6 2009. november 26. Real-time PCR Alapelv a PCR-termék képződésével arányos a fluoreszcencia intenzitása, ezt a készülék folyamatosan méri exponenciális fázisban: arányos a kiindulási DNS mennyiséggel nincs PCR-t követő gélelektroforézis Alkalmazások  génexpresszió vizsgálata  genomban többször előforduló gének számlálása (kópiaszám meghat.)  genotipizálás

7 2009. november 26. Real-time PCR Detektálás a keletkező összes PCR-terméket (nem specifikus) SYBR Green: dsDNS interkaláló festék Összemérés – Qiagility robot szekvencia specifikus: 5’ nukleáz (pl. TaqMan) Q 5’3’ R R Q : riporter : quencher QR 1 3 2

8 2009. november 26. ciklusszám RnRn CTCT Real-time PCR Mennyiségi mérés: a „threshold” ciklus ciklusszám lg  R n CTCT MHC08_G4 küszöb („threshold”) threshold: exponenciális fázisban threshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája a küszöbszintet – kiindulási DNS-mennyiséggel arányos

9 2009. november 26. Detektálás a reakció után: olvadáspont analízis Real-time PCR eltérő szekvenciájú DNS-szakaszok olvadáspontja különbözik lassú felmelegítésT m : két szál elválik SYBR Green jel 

10 2009. november 26. Kiértékelés Expressziós szintek összehasonlítása Kiértékelés Expressziós szintek összehasonlítása

11 2009. november 26.