Géntechnikák Laboratórium

Az előadások a következő témára: "Géntechnikák Laboratórium"— Előadás másolata:

1 Géntechnikák Laboratórium
Fehérjék stabilitása Géntechnikák Laboratórium

2 Centrális dogma Fehérje
DNS RNS Fehérje Replikáció Transzkripció Transzláció Fehérje A fehérjék aminosavak lineáris polimereiből felépülő szerves makromolekulák. A fehérjék aminosav sorrendjét a gének nukleotid szekvenciája kódolja a genetikai kódszótárnak megfelelően.

3 A fehérjestabilitás értelmezése-1
A biofizikusok a termodinamikai stabilitást értelmezik, mely szerint fehérjék reverzibilisen alakulnak át a natív és a denaturált forma között. Ebben az esetben a stabilitás leírható a két állapot között Gibbs- féle szabadenergia különbséggel: Minél nagyobb a különbség, annál stabilabb a fehérjeállapot. Jellemzően egy globuláris fehérjére ez a különbség viszonylag kicsi, Kb. 15kcal/mol.

4 A fehérjestabilitás értelmezése -2
A biokémikusok, biotechnológusok szempontjából kérdés, hogy adott körülmények mellett elég stabil-e funkciójának (pl. enzimaktivitás membrántranszport, szerkezetalkotás, stb.) ellátásához. Ha egy fehérje pl. a hőmérséklet emelésével denaturálódik, de a változás reverzibilis, a fehérjét funkcionális szempontból stabilnak nevezzük, míg termodinamikai szempontból a molekula instabilnak tekinthető. Irreverzibilis denaturáció esetén azonban az is fontos, hogy adott környezetben milyen gyorsan megy végbe a változás. Ilyen szempontból a változás sebességét kinetikus stabilitásként értelmezzük: A kinetikailag stabil fehérje átalakulásához nagyobb szabadenergia gát átlépése szükséges, az instabil állapot elérése több lépésben történhet :

5 A fehérjestabilitást befolyásoló faktorok
Hidrofób kölcsönhatások Hidrogénkötések Konformációs entrópia Ionos kötések Aromás kölcsönhatások Fém-kötések Diszulfid hidak

6 Fehérjék denaturációja
Okai: fizikai vagy kémiai behatások Fizikai: Hő UV-sugárzás Radioaktív-sugárzás Kémiai: pH Nehézfémek sói Fertőtlenítőszerek Formaldehid stb.

7 Célunk a stabilitás növelésénél, hogy a fehérjék jobban elviseljék:
Magasabb hőmérsékletet Extrém pH-t Extrém redoxpotenciált Szerves oldószert

8 Stabilitást növelő eljárások
stabilizálás során az enzimet valamilyen eljárással rögzítik a vízben oldható vagy oldhatatlan anyagokhoz az enzimet kémiailag módosítják különbözô adalékok (additívek), mint például cukrok és más poliolok (glicerin, glikol) alkalmazása megtaláljuk a fehérjemolekulát kódoló génszakaszt és ezen a génszakaszon hozunk létre mutációkat

9 A fehérjék konformációváltozásának
vizsgálatára alkalmas módszerek Fluoreszcens spektroszkópia Cirkuláris dikroizmus (CD) Röntgen diffrakció NMR Differenciál pásztázó kalorimetria (DSC) Fourier-transzformációs infravörös spektorszkópia (FTIR)

10 A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
Cirkuláris dikroizmus A CD spektroszkópiával egyszerűen és gyorsan nyerhetünk információt a fehérjék szerkezetéről, illetve szerkezetváltozásáról (pl. szubsztrátkötés, oligomerizáció, denaturáció, stb.). A távoli ultraibolya (UV) tartományban ( nm) felvett CD spektrumból következtethetünk a másodlagos szerkezeti elemek ( -hélix,  -szerkezet, rendezetlen/random coil láncok) meglétére, illetve ezek arányára a fehérje térszerkezetében, míg a közeli UV tartomány ( nm) az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról, vagyis a harmadlagos szerkezetrõl ad információt.

11 A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
Röntgen diffrakció Ahhoz, hogy mérhető röntgenszórást tapasztaljunk, sok ezer milliárdnyi fehérjemolekulából rendezett mintát kell előállítanunk. Általában ez azt jelenti, hogy a fehérjét kristályosítani kell. A fehérjék kristályosítása egyáltalán nem triviális feladat. A tapasztalat mégis azt mutatja, hogy megfelelő körülmények között a legtöbb fehérje kristályosítható.

12 A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
NMR-spektroszkópia Az NMR spektroszkópiás szerkezetvizsgálat szerencsésen kiegészíti a röntgendiffrakciós analízist, mert nem igényel rendezett mintát, s természetes, vizes környezetükben képes tanulmányozni a fehérjéket. Hátránya viszont, hogy ezzel a módszerrel nagyobb méretű - jelenleg 300 aminosvnál hosszabb - fehérjék nem tanulmányozhatók.

13 A fehérjék konformációváltozásának vizsgálatára alkalmas módszerek
Differencial pásztázó kalorimetria (DSC) A kalorimetriai mérés során a fehérjék térszerkezetének megváltozását a termodinamikai paramétereik vizsgálatán keresztül követjük nyomon. Általában az állandó nyomáson vett hőkapacitást mérjük, amiből következtethetünk az entalpia, entrópia és a szabad entalpia megváltozására.

14 Köszönöm a figyelmet! 