DNS-Chip Laboratórium

Az előadások a következő témára: "DNS-Chip Laboratórium"— Előadás másolata:

1 DNS-Chip Laboratórium
A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium DNA-chip Lab.BRC, Szeged

2 genetikai állomány hordozói sejtfunkciók ellátása
Kromoszómák genetikai állomány hordozói sejt DNS Gének információ hordozók mRNS AAAAAA AAAAAA AAAAAA Fehérjék sejtfunkciók ellátása

3 Néhány definíció „Genom, avagy a DNS birodalma”: egy szervezet
teljes DNS készlete. „Transzkriptom, avagy a hírvivő RNS-ek birodalma”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő mRNS készlet. „Proteom, avagy a fehérje birodalom”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő fehérje készlet. cDNS=copy DNS, az érett mRNS DNS-sé átírt változata Oligonukleotid=néhány tíz nukleotidból álló DNS darab DNA-chip Lab.BRC, Szeged

4 A genomprogram Humán Genom Projekt és a Celera Genomics nevű biotechnológiai óriás 2000-ben együttesen jelentették be az emberi genetikai állomány kódjának közel teljes megfejtését. 2001 februárjának közepén hozta nyilvánosságra eddigi eredményeit a világ két legrangosabb tudományos folyóiratában, a Nature, illetve a Science lapjain. „Az emberiség 100,000 éves történelmének egyik legfontosabb napja, hiszen az emberek először olvashatják el saját könyvük betűit” Craig Venter, a Celera igazgatója DNA-chip Lab.BRC, Szeged

5 Néhány érdekes adat az emberi genomról
Trillió sejt/szervezet 3 milliárd betű/sejt 2 méternyi DNS/sejt 1betű/mp, 24 óra/nap 100év. 1betű-mp, 16,5perc egy különbség. nukleotidot határoztak meg minden mp-ben Human Genome Project keretén belül 3 mm-es távolságban összerakva 9000 km lenne, több mint 2x hosszabb mint a Mississippi a korábbi feltételezésekkel (80-100ezer gén) ellentétben csak kb. 35ezer gén a genomnak csak 1-1,5%-a kódoló, azaz exon szekvencia egyenlőtlen géneloszlás-genetikai sivatagok egyenlőtlen a kromoszómális eloszlás is (az XY kromoszómák sokkal kevesebb gén tartalmaznak mint pl. a 17 vagy 22-es kromoszóma kb. 3millio SNP minden 1000 „beteg” a rasszok jobban hasonlítanak egymásra a két nem DNA-chip Lab.BRC, Szeged

6 A funkcionális molekuláris biológia lényege 1.
szövet, szerv szint G T P daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések Minőségi és mennyiségi változások funkciók felderítése G T P sejtosztódás, diffrenciáció, sejthalál sejt szint

7 A funkcionális molekuláris biológia és diagnosztika lényege (2)
Eltérő állapotok molekuláris hátterének felderítése Trombosis, sclerosis DNS RNS fehérje metabolitok vizsgálata Összehasonlítás egészséges szövettel Segítség: adatbankok, szekvenálási projektek DNA-chip Lab.BRC, Szeged

8 A funkcionális molekuláris biológia lényege 3.
P P P T aktív gének vizsgálata AAAAA Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések T Minőségi és mennyiségi változások követése G G

9 Chip-technológia Az 1990-es években egy forradalmian új technika,
fejlődött ki a gén és fehérje funkciók analízisére. Chip-technológia A biochipek nagyszámú (több ezer) cDNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek A biochipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak DNA-chip Lab.BRC, Szeged

10 A DNS-chip technolólgia komplementer nukleinsav-láncok hibridizációján alapul

11 Comparative molecular expression analysis
A. Examination of “transcriptome” B. Examination of “proteome” (generation of mRNA maps) (generation of protein maps) - Northern blotting - RNase protection/S1-mapping - Subtraction cloning - DNA arrays 1. Hybridization-based techniques - 2D gelelectrophoresis - MALDI-TOF mass spectrometry - combined electrophoretic and microsequencing techniques - “protein-chip” techniques - Differential display - RDA (representational difference analysis) 2. PCR-based techniques 3. Sequence-based techniques - ESTs (expressed sequence tags) - SAGE (serial analysis of gene expression) - DNA sequencing chip - Mass spectrometry sequencing DNA-chip Laboratory, BRC. Szeged

12 Dot-blot technika Reverz dot-blot technika DNS-chip technika
Radioaktív génspecifikus próba Dot-blot technika A pozitív RNS minták jelölődnek Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve Hibridizáció Teljes RNS jelölése Reverz dot-blot technika Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek Hibridizálás DNS-chip technika 100-20,000 Génspecifikus minta DNA-chip Lab.BRC, Szeged

13 A chipek hordozó szerinti osztályozása
macroarray nylon membránon néhány 100 génspecifikus minta (DNS darab) radioaktív jelölés kis minta sűrűség ( pont/cm2) microarray üveglemezen több génspecifikus minta (DNS darab) fluoreszcens jelölés közepes mintasűrűség (5000 pont/cm2) chip üveglemezen több génspecifikus minta (DNS darab) fluoreszcens jelölés nagy minta sűrűség (10.000pont/cm2)

14 Hibridizálás, fehérje-ellenanyag
Egy chipkísérlet lépései cDNS klón és/vagy DNS szekvencia biológiai minta szövetből, sejtkultúrából nyomtatás Makroarray Mikroarray Chip mRNS, DNS, fehérje Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás néhány 100, vagy több 1.000, gén, fehérje jelölt minta X adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó információk értékelése

15 cDNS alapú chip készítése
Egyedi baktérium klónok izolálása kék/fehér szelekció CHIPKÉSZÍTÉS Ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS darabokat tartalmazó klónok PCR amplifikáció 96 mintahelyes lemezeken cDNS könyvtár baktériumban PCR reakció ellenőrzése Tisztítás felcsepegtetés üveglemezekre Minden lemezen több 1000 ismert és ismeretlen szekvenciájú cDNS darab szerepel duplikátumban DNA-chip Lab.BRC, Szeged

16 Microgrid ArrayerBioRobotics, UK
DNA-chip Lab.BRC, Szeged

17 Microgrid Arrayer BioRobotics, UK
84 lemez 24 mikrotiter lemez (384) Sebesség: 6400 pont < 4h. Sűrűség: pont/lemez DNA-chip Lab.BRC, Szeged

18 Nyomtatótű a MicroArrayer robothoz
DNA-chip Lab.BRC, Szeged

19 Making microarrays by mechanical microspotting and ink jetting
Sample is loaded into a spotting pin by capillary action Microarray After the first spotting cycle, the pin is washed and the next sample is loaded and deposited Small volume is transferred to a solid surface by physical contact between the pin and the solid surface Touch surface Move pins Wash, repeat Same sample can be transferred with the same pin to the next solid surface generating multiple arrays 2. Ink jetting Microarray Sample is loaded into a miniature nozzle equipped with a piezoelectric fitting An electrical current is used to expel a precise amount of liquid from the jet onto the surface Second sample is loaded and deposited to an adjacent address Deliver drop Move jets Wash, repeat DNA-chip Lab.BRC, Szeged

20 Oligonukleotid alapú chip készítése 1. szintetikus oligonukleotidok
kémiai kikötése

21 Oligonukleotid alapú chip készítése 2.
in situ szintézis Affymetrix CHIPKÉSZÍTÉS DNA-chip Lab.BRC, Szeged

22 Semi conductor Microarrays
1. Semiconductor Base 2. Scalable Density 3. Active Device - Computer Controlled Electro-Chemistry Multiplex in situ custom DNA synthesis 1k and 10k features available

23 In situ MicroArray DNA Synthesis
5 4 1 60 Cycles 3 2

24 In situ MicroArray DNA Synthesis
5 4 1 60 Cycles 3 2

25 Scalable Technology Platform
1K 1024 Features 10K 13,416 Features

26 pl. PCR- felskszorozott cDNS klónok
Nagyobb DNS molekulák pl. PCR- felskszorozott cDNS klónok kovalens kikötése aktivált tárgylemezre DNA-chip Lab.BRC, Szeged

27

28 Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció
Mire alkalmasak a chipek? Mutációk, Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció Genom G Gén kifejeződés megváltozása Transzkriptom T mRNS AAAAA DNS-chipek Fehérjék Kifejeződés, módosítások, kölcsönhatások Proteom P Fehérje-chipek DNA-chip Lab.BRC, Szeged

29 Pontmutációk (SNP) detektálása
Oligonukleotid alapú chipek egy nukleotid eltérés azonosítása 1. SNP 3 pozíció A G T C 2. SNP 2 pozíció Jelölt DNS hibridizáció mosás DNS detektálás Adat analízis 1. SNP: 3. pozíció A-C 2. SNP: 2. pozíció C-T DNA-chip Lab.BRC, Szeged

30 relatív aktivitás mérése
Génkifejeződés tanulmányozása – cDNS vagy oligonukleotid chip – transzkriptom analízise – aktív-inaktív gének detektálása – bonyolult adat és statisztikai analízis Jelölt cDNS aktív gének vizsgálata hibridizáció mosás AAAAA mRNS detektálás Adat analízis: relatív aktivitás mérése a színessel jelölt gének aktívak a feketék nem biológiai anyag DNA-chip Lab.BRC, Szeged

31 Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise
beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet RNS tisztítás cDNS írás RNS-ből (reverz transzkripció) Cy5 dCTP Cy3 dCTP jelölt cDNS jelölt cDNS Hibridizáció, mosás Szkennelés DNA-chip Lab.BRC, Szeged

32 Arabidopsis génmintát tartalmaz
cDNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata RNS cDNS cDNS-chip 4000 különböző Arabidopsis génmintát tartalmaz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

33 Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata
Mycobacterium tuberculosis-ban cDNS-chip technikával 3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a) PCR génspecifikus primerekkel, tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevont mikroszkóplemezekre robot segítségével 1. cDNS-chip készítése 2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból RNS izoláció, jelölt cDNS készítése Cy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával Reverz transzkripció reakcióban. Kezeletlen, kontroll baktériumok Isoniaziddal kezelt 3. Hibridizáció EREDMÉNYEK: - Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt. - további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt - egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel. 4. Adatfeldolgozás PNAS (1999) 96,

34 cDNS-chipek alkalmazásai: (2) eltérő állapotokért felelős génexpresszió
különbségek vizsgálata RNS cDNS Új gének azonosítása Génfunkciók jellemzése Génkölcsönhatások megértése Differenciáció tanulmányozása Tumorképződés vizsgálata Gyógyszerek felfedezése cDNS-chip 6000 különböző egyedi egér génmintát tartalmaz DNA-chip Lab.BRC, Szeged

35 Egészséges és dagantos (HBL100 vs
Egészséges és dagantos (HBL100 vs. breast carcinoma BT474) szövetek génkifejeződéseinek összehasonlítása DNA-chip Lab.BRC, Szeged

36 Paraffinba ágyazott minták
Genomszintű változások, kromoszóma rendellenességek, amplifikációk, deléciók detektálása DNS PCR Paraffinba ágyazott minták normál daganat Génátrendeződési arányok -16 -11 -6 -1 4 9 01 p 01 p13-p21 01 p 01 p34.2 01 p36.31 01 q21 01 q21.1 01 q 01 q21.3 01 q24-q25 01 q31-q32 02 p13-p12 02 q13 02 q34-q35 03 p21.1-9 03 p21.3 03 q 03 q21.1-q21.2 04 p16.3 06 p21.3 06 p21.31 06 q27 07 p15.3-7p14 07 p21.3 08 p23 08 q21.2-q21.3 09 p 09 p13 09 q21.2 09 q32-q33.3 10 p11.2 11q23 12 p13 12 q 13 q32.2 14 q24-q31 16 q23.1 17 p13 18 p11.1-q11.2 18 q21.3 19 p13.2 19 q13.12 19 q13.4 19 q13.43 20 q11.22 20 q13.33 21 q22.1 22 q13.1 Xp11.3-p11.23 Tüdő génarány agy génarány Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása

37 Képanalízis jelölt cDNS jelölt cDNS Lézer szkenner Lézer szkenner Cy5
beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet Cy3 dCTP Cy5 dCTP jelölt cDNS jelölt cDNS

38 ? Nem szignifikáns adatok ADATFELDOLGOZÁS „Árnyékzóna”

39 Cy-3, Cy-5 jelek kvantitatív összehasonlítása
Quantarray szoftverrel (GSI Lumonics) Arány és intenzitás megszorítások nélkül Arány és intenzitás megszorításokkal DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

40 DNS-chipek képanalízise

41 Adatfeldolgozás, statisztikai analízis
R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk) R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1))) R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF) R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x, IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2, (RMN1Rep+RMN1x)/2,""))))

42 Slide 42

43 Ábrázolási módszerek 1. normál arány
Ratio Cy5/Cy3 Spot label

44 Ábrázolási módszerek 2. log2 arány

45 Jövő: Leukémiák molekuláris osztályozása génexpresszió monitorozással
DNS-chipek alkalmazásával - Új alosztályok felfedezése - Új esetek osztályozása - Jóslat kemoterápiás kezelés hatékonyságára - Atipikus esetek tisztázása Jövő: - Tumorminták gyűjtése - Kemoterápia jellemzése - Expressziós analízis - Adatbank létrehozása - Alosztályok meghatározása - Kemoterápiára adott válaszok jellemzése DNS-chipekkel - hatásmechanizmus feltárása - rezisztenciáért felelős gének azonosítása Science 1999, 286, 531.

46 B-sejt limfómák osztályozása
Alizadeh et al., Nature, 2000, 403,

47 Mintaelőkészítés, csoportosítások terve
krónikus mieloid leukémiák osztályozásához Teszt és általános gének azonosítása: CML 1. beteg 2. beteg x. beteg RNS cDNS hibridizálás Későbbi kimenetel 1. típus 2. típus 3. típus diagnózis kezelés korai reakció RNS kontrol relapszus tünetmentesség

48 Génexpressziós klaszterek patkány fejlődése során
The time of birth is marked by a vertical line a. Normalized gene-expression trajectories are shown grouped by waves that are determined by clustering. The graphs below show the average normalized expression pattern or wave over the nine time points for all of the genes in each cluster. b. Tree of all gene-expression pattern. c. Plots of all normalized time series, highlighted wave 3. DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

49 Dataprocessing and visualization
Sejtosztódást gátló, apoptózist serkentő vegyület hatásának vizsgálata 3 sejttenyészeten 2 különböző koncentrációban humán cDNS-chippel Repression of cell division Imaging: „tree” & „galaxis” clastering methods