Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium

Az előadások a következő témára: "Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium"— Előadás másolata:

1 Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium
kv1n1lv1 Bemutatkozás

2 UV/VIS detektorhoz képest:
Fluoreszcenciás detektor – FLD UV/VIS detektorhoz képest: Érzékenyebb Szelektívebb (Csak fluoreszkáló komponensek detektálására alkalmas)

3 Fluoreszcenciás detektor – FLD

4 Az antracén gerjesztési és emissziós spektruma metanolban
Fluoreszcenciás detektor – FLD Az antracén gerjesztési és emissziós spektruma metanolban Vibrációs alszintek p* gerjesztés gerjesztés Intenzitás h1 emisszió h2 p emisszió excitation Wavelength / nm

5 Fluoreszcenciás detektor – FLD

6 Fluoreszcenciát befolyásoló tényezők
Fluoreszcenciát csökkentő tényezők: Oldott oxigén vagy más szennyező

7 Fluoreszcens detektálást befolyásoló egyéb tényezők
A mérendő komponens koncentrációja; Gerjesztési forrás intenzitása; Besugárzott minta térfogata (cella térfogat); A z emittált fényt elnyelő oldószer, vagy oldott anyagok (koelució, szennyezések); A szórt fény megnöveli a zajt (nagy molekulák, más fényvisszaverő felület)

8 PAH-ok mérése HPLC-FLD-vel Gerjesztési / emissziós hullámhossz lex/lem
225/314 246/368 237/440 230/330 277/376 255/420 230/400 250/495

9 Elektrokémiai (amperometriás) detektor-ECD
Olyan vegyületek detektálására alkalmazzuk, amelyek un. „elektroaktív” csoportot tartalmaznak. Ezek a csoportok könnyen: Oxidálódhatók Redukálhatók Szerkezet megvizsgálásával és egy ciklikus voltammogram felvételével tervezhetővé válik.

10 Elektrokémiai (amperometriás) detektor-ECD
Előnyök: Igen szelektív, igen érzékeny Hátrányok: Fémek jelenléte jelentősen zavarja (Fe, Ni, etc.). Gradiens nem alkalmazható Kis hőmérséklet- és áramlás- ingadozások is zavarják = NEM ROBOSZTUS 10

11 Elektrokémiai (amperometriás) detektor - ECD
Oxidálható Redukálható Fenolok Ketonok Oximok Aldehidek Merkaptánok Peroxidok Konjugált savak/észterek/nitrilek Hidroperoxidok Konjugált kettőskötés Aromás aminok, diaminok Aktív halogén Purin vázasok Aromás halogén Nitrovegyületek

12 Radiokémiai detektor - RD
A mérendő komponens rádióaktivitása által kiváltott fény emissziót méri (Heterogén – homogén szcintilláció) Fő alkalmazási terület: metabolizmus kutatásban Mérhető pl: 35S, 14C, 3H, 131I

13 Fényszórásos detektor – Evaporative Light Scattering Detector, ELSD
Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot elhagyó eluenst elporlasztjuk. Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog. 3. Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A részecskék által szórt fényt detektáljuk. A detektált fény arányos a részecskék számával (koncentrációjával).

14 ELSD

15 Refraktív index (törésmutató) detektor – RID
Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, ha az elválasztott komponensek törésmutatója eltér az eluens törésmutatójától; Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens összetétel változás már a törésmutató változását idézheti elő); Hőmérséklet változás (0,001C –ra termosztáljuk); Pumpa pulzálás kontroll !!!! Off-line eluens keverés

16 RID

17 Izokratikus ill. gradiens elúció
tR (min) mAU GRADIENS tR (min) mAU

18 Izokratikus ill. gradiens elúció Az eluens erősség változása
F B C D E B+C D+E 30% ACN 70% 20mM Foszfát, pH=6.95 50% ACN 50% 20mM 80% ACN 20% 20mM A: Feniletilamin B: Piridin C: 2-Picolin D: 2,4 Lutidin E: 4-ethylpiridin F: 2,3 dimetilanilin Az eluens erősség változása

19 Gradiens elúció

20 Gradiens elúció Gradiens elúció problémák: Egyensúly beállás idő; Mozgófázis tisztasága („0” –lépésként oldószer ellenőrzése); Retenciós sorrend (szelektivitás) változása; Oldószer probléma (k>10 vs. a minta oldása); Detektor kompatibilitás (pl. RI detektor).

21 Gradiens elúció – nyomás profil Viszkozitás – összetétel összefüggés
Kísérleti körülmények: Purosphere C18, 5mm; 125*3mm, 25C 0,56ml/perc 1 ml/perc 75% AcN 100% AcN 0,56ml/perc

22 MIP-Molecularly Imprinted Polimer
Célvegyület Célvegyület Monomerek Elrendeződés Polimerizáció (UV vagy T) Célvegyület Extrakció MIP - célvegyület

23 MIP-Molecularly Imprinted Polimer
MIP-alkalmazás

24 Affinitás kromatográfia
Alkalmazások: Immunaffinitás kromatográfiával az oszlopon megkötött antitestekkel (antibodies) antigéneket tisztítunk; Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálására; Ellenanyaggal tisztíthatjuk azt a vegyületet, amely az ellenanyagot termelte; Immobilizált antitestekkel toxinokat kötnek meg vérből (hemoperfúzió); Szilárd fázisú immunoassay alkalmazásokban. Az ipar biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek ipari méretekben történő gyártására. Biospecifikus reverzibilis Enzim szubsztrát Hormon- receptor Nukleinsav Szelektív, kíméletes, egyszerű, gyors Bonyolult készítés, drága

25 Affinitás kromatográfia
Állófázis (mátrix) 90%-ban agar-agar gél, a többi sephadex gél, cellulóz származékok vagy egyéb polimer. ligandum távtartó + + + + + + + +

26 Affinitás kromatográfia
1. Kondicionálás Puffer

27 Affinitás kromatográfia
2. Mintafelvitel és mosás Puffer

28 Affinitás kromatográfia
2. Eluálás Eluáló szer

29 Affinitás kromatográfia
egyensúly Minta megkötődése, egyéb komponensek eluálása Minta eluálása egyensúly Abszorbancia mAU váltás elúciós pufferre mintafelvitel 1-2 ot. x ot. 1-2 ot. >1 ot. 1-2 ot. Oszlop térfogat (ot)

30 Affinitás kromatográfia
Immobilizált fém affinitás kromatográfia (immobilized metal affinity chromatography - IMAC) Immobilizáljuk a fémet kelát képző ligandumok segítségével; Különböző stabilitású komplexek képződnek a fém és olyan proteinek között, amelyek elektron donor csoportot tartalmaznak (pl hisztidin, triptofán, cisztein vagy foszfát csoport). A komplex stabilitása függ a ligandum, fém típusától, elektron donor csoport sztérikus hozzáférhetőségétől, hőmérséklettől, pH és kompetitív donor jelenlététől. Alkalmazott pH=6-8. Eluálás pH gradienssel vagy a glicin, hisztidin, hisztamin, cisztein koncentrációjának növelésével (N és/vagy S tartalmú vegyületek, amelyek erős elektron donorként leszorítják a proteint a fémről).

31 A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI
MODELLJE

32 102-108 Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása
Gélkromatográfia Dalton méretű molekulák méret szerinti elválasztása Alkalmazások: Polimerek, polimer adalékok vizsgálata; Biopolimerek, peptidek, enzimek elválasztása; Molekulatömeg eloszlás, átlag molekulatömeg meghatározás; Minták tisztítása (peszticidek meghatározása élelmiszer mátrixból); A minta sómentesítése; Puffer csere.

33 Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!!
Gélkromatográfia Gél szemcse Pórusok (dp> 100A) Állófázis a kolonnában Nincs kölcsönhatás a minta-molekula és az állófázis között!! Eltérő méretű molekulákból álló minta

34 Eltérő méretű molekulákból álló minta
Gélkromatográfia „Fordított szita” Abs 265nm Idő (perc) Eltérő méretű molekulákból álló minta

35 Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány
Gélkromatográfia Teljes kizárási tartomány- az a nagyobb molekulaméret amelynél nincs visszatartás (holt térfogat); Mérési (működési) tartomány - az a molekulaméret, amelynél van visszatartás; Teljes áteresztési tartomány – nagyon kis molekulák, amelyek teljesen átjárják a pórusokat (a retenciós idő konstans); Teljes áteresztési tartomány Mérési tartomány Teljes kizárási tartomány lgM V (ml)

36 Sómentesítés gélkromatográfiával
Gélkromatográfia Sómentesítés gélkromatográfiával

37 Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával
Gélkromatográfia Antitest tisztaságvizsgálata gélkromatográfiával

38 MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL
Gélkromatográfia MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

39 A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
Gélkromatográfia A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

40 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia

41 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Quaterner alkil ammónium só) N+ Ion-párképző só [Molekula ION]- Mérendő komponens ionos formája C18 szilárd fázis N+ [Molekula ION]-

42 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Ionpárképző reagens (Alkil szulfonsav só) Ionpárképző só S O O- [Molekula ION]+ Mérendő komponens ionos formája C18 szilárd fázis O S [Molekula ION]+ O- Esetleg: CF3COO-; BF4-; ClO4-, PF6-

43 Ionpárképző mechanizmus (ioncserés modell)
Na+ [ION]+ SO3-Na+ SO3- SO3-Na+ Módosított állófázis C18 szilárd fázis

44 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia
Az RP-IP_HPLC-ben változtatható paraméterek: Ionpárképző koncentrációja; Ionpárképző jellege (típusa, lánc hossza, stb.) Szerves modifikátor típusa, mennyisége; Puffer koncentrációja, pH-ja; Idegen só koncentrációja;

45 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – a szerves fázis hatása

46 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa

47 Ionpár fordított fázisú folyadékkromatográfia – ionpárképző típusa
Idegen só hatásáról Tóninál van ábra

48 Ioncserés folyadékkromatográfia

49 Ioncserés folyadékkromatográfia
Ioncsere: ha az állófázis állandó töltéssel rendelkezik; Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g); „Ioncserélő gyanták” Ionkizárásos kromatográfia Ionkromatográfia

50 AMFOTER (kevert) TIPUSOK
Ioncserélő töltetek KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, PO4-) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel ERŐS - GYENGE IONCSERÉLŐK DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

51 Ionkizárásos folyadékkromatográfia
Állófázis: nagy ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer (ritkán kis szerves oldószer tartalommal); Alkalmazásai: fermentlevek, szeszesital, üdítőital gyártás (cukrok, savak, alkoholok elválasztása) HOOC-R HO-R Cukor SO-3 SO-3 -OOC-R pórus

52 Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta;
Ionkromatográfia A szervetlen anionok, kationok vagy vízben oldódó szerves savak és bázisok meghatározására használjuk Állófázis: kis ioncserélő kapacitású anion vagy kation cserélő gyanta; Eluens: puffer; Detektor: vezetőképesség (elektrokémiai) ionelnyomó után.

53 Ionkromatográfia Hordozó Típus Üveggyöngy ioncserélő bevonattal
Jellemzők Üveggyöngy ioncserélő bevonattal Filmszerű (37-44 mm) Gyors elválasztás, közepes hatékonyság, kis kapacitás, pH 2-8, szárazon töltik, könnyen beszennyeződik Szilikagél alapú Mikropórusos (10 nm) Közepes gyorsaság, leghatékonyabb, pH 2-8, pépes töltés Polisztirol Lassú, kis hatékonyságú, jó kapacitás, pH 0-12, pépes töltés

54 Visszatartást befolyásoló tényezők:
Ionkromatográfia Visszatartást befolyásoló tényezők: Növekvő pH Nő a savak ionizációja – nő a visszatartás; Csökken a bázikus vegyületek ionizációja – gyorsan eluálódnak; Puffer erősség nő Ioncserélő felületeken megnő a versengés – csökken a retenció; Nő a hőmérséklet Egyensúly kedvez a mozgó fázisnak – csökken a retenció.

55 Ionkromatográfia

56 Szupresszió előtt Vezetőképesség mS Szupresszió után Idő (min)
Ionkromatográfia Szupresszió előtt Szupresszió után Vezetőképesség mS Idő (min)

57 Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3):
Ionkromatográfia Szupresszió ioncserés oszloppal (Regenerálni kell!!) cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése (S/N növelése) Cl- meghatározása    Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens NaHCO3): Gyanta-H+  + Na+ HCO3  --> Gyanta-Na+  + H2CO3 Gyanta-H+  + Na+ Cl-       -->  Gyanta-Na+  + HCl A mozgófázis vezetőképessége jelentősen csökken, az elválasztott ion vezetőképessége a Na ion (50 S*Cm2/equiv.) H ionnal (350 S*cm2/equiv.) történő cseréjével jelentősen megnő. Na+ meghatározása    Az ionelnyomóban lejátszódó folyamatok (eluens HCl): Gyanta-OH- + H+ Cl-  -->  Gyanta-Cl- +   H2O Gyanta-OH- + Na+ Cl- --> Gyanta-Cl- +   Na+ OH- A mozgófázisból víz lesz, a mintában pedig lecseréljük a Cl- (76 S*cm2/equiv) ionokat OH- ionokra (198 S*cm2/equiv).

58 Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
Ionkromatográfia Alkalmazás (Anion referencia oldat); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop

59 Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3
Ionkromatográfia Alkalmazás (vízminta); 0,5M Na2CO3 és NaHCO3 IonPac® AS14; 4*250mm oszlop és IonPac® AG14; 4*50mm előtétoszlop

60 Ionkromatográfia

61 IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA
Ionkromatográfia 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐN (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column)

62 Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia
(Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC)

63 Hidrofób kölcsönhatású kromatográfia

64 Mindkét technikában közös és jellemző:
HIC vs. RPC Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Alkalmasak fehérjék elválasztására.

65 HIC vs. RPC KÜLÖNBSÉGEK: - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező RP- hidrofób hatásért a ligandum HIC nél a só által okozott kozmotróp hatás HIC gyenge szorpció nincs denaturáció Elució Rpnél ap növ HIC só onc mód

66 Hidrofil kölcsönhatású folyadékkromatográfia
(Hidrophilic Interaction Liquid Chromatography; HILIC)

67 (A víz az erős oldószer !!!)
HILIC Állófázis: mint a normál fázisú kromatográfiában Eluens: mint a fordított fázisú kromatográfiában 3-40% vízzel (A víz az erős oldószer !!!) Alkalmazásai: RP-hez túl poláros, nehezen visszatartható komponensek elválasztására

68 HILIC példa 1. Fucose

69 HILIC példa 2.