The key experiment of Nobumichi Hozumi and Susumu Tonegawa

Az előadások a következő témára: "The key experiment of Nobumichi Hozumi and Susumu Tonegawa"— Előadás másolata:

1 The key experiment of Nobumichi Hozumi and Susumu Tonegawa

2 AZ IMMUNOGLOBULIN POLIPEPTID LÁNCOKAT TÖBB GÉN SZEGMENS KÓDOLJA
AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ELRENDEZŐDÉSE Chromosome 2 kappa light chain gene segments Chromosome 22 lambda light chain gene segments Chromosome 14 heavy chain gene segments AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK SZÁMA Variábilis (V) Diverzitás (D) Kapcsoló (J) Gene segments Könnyű lánc Nehéz lánc kappa lambda

3 AZ ANTIGÉN RECEPTOROK SOKFÉLESÉGE Egy egyed különböző B limfocitái
VH D JH VL JL V-Domének C-Domének VH-D-JH VL-JL

4 Hogyan működik a szomatikus rekombináció ?
Hogyan jön létre a végtelen számú sokféleség a korlátozott számú gén szegmensek részvételével? Kombinációs sokféleség

5 A kombinációs sokféleség becslése
A funkcionális V, D és J gének száma: 65 VH x 27 DH x 6JH = 10,530 kombináció 40 Vk x 5 Jk = 200 kombináció 30 Vl x 4 Jl = 120 kombináció = 320 különböző könnyű lánc Amennyiben a H és L láncok véletlenszerűen párosodnak mint H2L2 10,530 x 320 = 3,369,600 lehetőség Csak a KOMBINÁCIÓS sokféleség A valóságban bizonyos H + L kombinációk nem fordulnak elő, mert instabilak Bizonyos V és J gének gyakrabban fejeződnek ki, mint mások A KAPCSOLÁSI sokféleség tovább növeli a szekvenciák számát A POTENCIÁLIS B-SEJT KÉSZLET KIALAKULÁSA

6 Hogyan működik a szomatikus rekombináció ?
Hogyan jön létre a végtelen számú sokféleség a korlátozott számú gén részvételével Kombinációs sokféleség Hogyan találja meg a V régió a J régiót és miért nem a C régióhoz kapcsolódik ? szabály Speciális - Recombination Signal Sequences (RSS) Recognized by Recombination Activation Gene coded proteins (RAGs) PALINDROM SEKVENCIÁK HEPTAMER CACAGTG CACAGTG GTGACAC GTGACAC NONAMER ACAAAAACC GGTTTTTGT TGTTTTTGG CCAAAAACA

7 9 7 D J 7 9 V A 12-23 szabály molekuláris magyarázata
Rekombinációs szignál szekvenciák RSS 23-mer = két fordulat 12-mer = egy fordulat Közbeeső, bármely hosszúságú DNS 23 V 9 7 12 D J 7 9 Heptamer Nonamer Heptamer Nonamer

8 A V, D, J gén szegmenseket határoló szekvenciák
A V, D és J elemek előtt konzervált nukleotid szekvenciák helyezkednek el, amelyek mindig 7, 23, 9 és 12 nukleotidból állnak és a lókuszra jellemző elrendeződést mutatnak Vl 7 23 9 Jl 7 12 9 Vk 7 12 9 Jk 7 23 9 D 7 12 9 VH 7 23 9 JH

9 Recombinációs szignál szekvenciák (RSS)
HEPTAMER – Mindig folytatólagos a kódoló szekvenciával NONAMER – A heptamertől 12 vagy 23 nukleotid választja el VH 7 23 9 D 12 JH   VH 7 23 9 D 12 JH 12-23 SZABÁLY – A 23mer által határolt gén szegmens csak a 12mer RSS határolt gén szegmenssel tud kapcsolódni

10 V1 D J 9 7 A 12-23 szabály molekuláris magyarázata V2 V3 V4 V8 V7 V6
A közbeeső DNS hurok kivágódik V8 V7 V6 V5 A heptamerek és nonamerek visszafelé illeszkednek Az RSS által kialakított alakzat a rekombinázok célpontja 7 9 23-mer 12-mer V9 D J Két 23-mer vagy két 12mer nem tudja kialakítani a megfelelő alakzatot

11 V1 D J 9 7 A REKOMBINÁCIÓ KÖVETKEZMÉNYEI V4 V5 V3 V6 V2 V7 V8 V9
RAG complex kötődik és hasítja a rekombinációs szignál szekvenciát ami hajtű képződést eredményez 7 9 23-mer 12-mer A hajtű RAG-közvetítette hasítása palindróm szekvenciákat eredményez

12 V1 D J 9 7 V4 V5 V3 V6 V2 V7 V8 V9 Loop of intervening DNA is excised
N-nucleotid hozzáadást TdT enzim által Terminal deoxynucleotidyl Transferase Loop of intervening DNA is excised Pár képződés 7 9 23-mer 12-mer A páratlan nekleotidok eltávolítása exonukleázok révén A hiányzó nukleotidok hozzáadása DNS szintézissel, ligálás kódoló szekvenciává

13 PALINDROM SZEKVENCIÁK
RSS - Recobnitation Signal Sequence RAG – Recombination Activation Genes RSS RSS cleavage RAG1 RAG2 PALINDROM SZEKVENCIÁK HEPTAMER CACAGTG CACAGTG GTGACAC GTGACAC NONAMER ACAAAAACC GGTTTTTGT TGTTTTTGG CCAAAAACA SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS Kettős szálú DNS (dsDNS) enzimatikus hasítása, kivágás és újra kapcsolás (deléció, religálás) Véletlenszerű rekombináció IRREVERZIBILIS Antigéntől független Meghatározott sorrendben történik Speciális rekombináz enzimek RAG1/RAG2 Korlátozott kifejeződés Speciális helyeken (csontvelő, tímusz) A limfocita érés adott szakaszában Ku protein

14 Somatic recombination to generate
antibody diversity Immunoglobulin genes are composed of separated segments of DNA that become joined together by a process called somatic recombination to make a functional gene. In heavy chain genes there are three gene segments, the variable or V segment, a diversity or D gene segment, and the joining or J segment. Light chain genes, such as those shown here, have only two gene segments - the V and the J segments. Gene segments that can be recombined have specific sequence motifs adjacent to them, called recombination signal sequence, or RSS motifs. A protein complex containing the products of the recombination activator genes, RAG1 and RAG2, binds specifically to the RSS motifs, in this example flanking a V gene segment and a J gene segment. The individual gene segments, to whose flanking RSS motifs the RAG protein complexes bind, are selected at random from a number of copies present at each gene locus. The Rag protein complexes bring together the gene segments to be recombined, and cleave the DNA exactly at the junction of the gene segment and it's adjoining RSS motif. The cleavage creates a hairpin of DNA at the ends of the gene segments and double stranded breaks at the ends of the RSS motifs. Additional proteins, DNA-dependent protein kinase, Ku, Artemis and a dimer of DNA ligase and XRCC4, are incorporated into a large complex with the RAG proteins. These RSS ends are joined, forming what is called the "signal joint", to create a closed circle of DNA that plays no further role in the recombination process. The DNA hairpins at the ends of the gene segments are then cleaved. An additional enzyme, terminal deoxynucleotidyl transferase or TdT, is recruited and adds additional nucleotides to the ends of the DNA strands The other enzymes in the complex ligate together the two ends of the gene segments, completing the recombination process. 14

15 Hogyan működik a szomatikus rekombináció ?
Hogyan jön létre a végtelen számú sokféleség a korlátozott számú gén részvételével Kombinációs sokféleség Hogyan találja meg a V régió a J régiót és miért nem a C régióhoz kapcsolódik ? szabály Hogyan történik a DNS törés és újrakapcsolódás ? Pontatlanul, véletlenszerű nukleotid eltávolítással és hozzáadással, ami tovább növeli a szekvencia sokféleséget Kapcsolási sokféleség

16 Kapcsolási sokféleség
7 12 9 23 7 12 9 23 A kivágódó DNS hurok folyamatosan elvész a genomból Szignál kapcsolat Kódoló kapcsolat V D J V D J A nem pontos és véletlenszerű DNS törések összekapcsolása nukleotidok elvesztését és/vagy beépülését eredményezi a kódoló kapcsolat kialakulása során

17 V D J TCGACGTTATAT AGCTGCAATATA TTTTT Kapcsolási sokféleség
Csíravonalban kódolt nukleotidok Palindrom (P) nukleotidok – újak Nem-template (N) kódolt nukleotidok - újak A V, D és J régiók között gyakorlatilag random szekvenciák alakulnak ki

18 A D szegmens 3 keretben olvasható
A D regió különböző ellenanyagokon végzett analízise azt mutatta, hogy ugyanaz a D régió mindhárom keretben leolvasható, ami eltérő fehérje szekvenciát és ellenanyag specificitást eredményez GGGACAGGGGGC GlyThrGlyGly GlyGlnGly AspArgGly Keret 1 Keret 2 Keret 3

19 Súlyos kombinált immunodeficiencia szindróma (SCID)
SCID is characterized by a lack of functional T cells and B cells and the inability to make an adaptive immune response. Infants with SCID typically show infections with opportunistic pathogens. Panel a shows chronic Candida albicans infection in the mouth of an infant with SCID. SCID can be caused by various genetic defects, one of which is complete loss of RAG function. Panel b shows an infant with Omenn syndrome, a similar immunodeficiency which is due to a genetic defect that results in 80% loss of RAG activity. The bright red rash on the face and shoulders, which is due to chronic inflammation, is a characteristic of this condition. Unless an immune system can be reconstituted by bone marrow transplantation from a healthy donor, babies with SCID or Omenn syndrome die in infancy. Panel a courtesy of Fred Rosen; panel b courtesy of Luigi Notarangelo. Omen szindroma - RAG deficiencia Korai tünetek Bélmozgás gyenge Egész testen vörös pikkelyes kiütés Opportunista fertőzések (Candida albicans, Pneumocystis carnii pneumonia) Nincsenek tapintható nyirokcsomók 19

20 A CSONTVELŐBEN ZAJLÓ SZOMATIKUS GÉNÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE
Az Ig génszegmensek szomatikus átrendeződése ellenőrzött sorrendben, meghatározott program szerint megy végbe Egy egyed különböző B-limfocitáiban a gén szegmensek kombinációja nagy számú, egymástól eltérő nehéz és könnyű lánc variábilis régiót eredményez Egy adott egyed teljes B-sejt készlete eltérő módon átrendezett, eltérő variábilis régióval rendelkező B-limfocitából áll A B-SEJT KÉSZLET SOKFÉLE ANTIGÉN FELISMERÉSÉRE KÉPES 4. Egy B-sejt az allél kizárás eredményeként csak egyféle nehéz és egyféle könnyű láncot szintetizál ELKÖTELEZETTÉ VÁLIK EGY ADOTT ANTIGÉN KÖTŐ HELY KIALAKÍTÁSÁÉRT AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE

21