Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése k cat [s -1 ] enzimvíz carbonic anhydrase 6x10 5 10 -9 acetylcholine esterase 2x10 4 8x10 -10 staphylococcal.

Az előadások a következő témára: "Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése k cat [s -1 ] enzimvíz carbonic anhydrase 6x10 5 10 -9 acetylcholine esterase 2x10 4 8x10 -10 staphylococcal."— Előadás másolata:

1 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése k cat [s -1 ] enzimvíz carbonic anhydrase 6x10 5 10 -9 acetylcholine esterase 2x10 4 8x10 -10 staphylococcal nuclease 10 2 2x10 -14

2 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése entrópia sztérikus hatások dinamikus hatások deszolvatáció alacsony energiájú hidrogénkötések kvantum effektusok (tunneling) elektrosztatikus effektusok (szolvatáció) Elméletek

3 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Reaktánsok destabilizálása (DRS) TS R P Reakciókoordináta Energia w p Átmeneti állapot stabilizálása (TSS) TS R P Reakciókoordináta Energia w p entropy, steric strain, orbital steering, desolvation solvation

4 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Entrópia faktor Oldószerben a reaktánsok egy „üregbe” (solvent cage) kerülését entrópiaveszteség kíséri. Enzimben már egymás közelében vannak. 100 szoros sebességnövekedés

5 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Entrópia faktor AB C AB ‡ A + B C AB ‡ bimolekuláris reakció monomolekuláris reakció gázfázisban 13-14 kcal/mól entrópia csökkenés effektív koncentráció: 10 9 oldószerben: effektív koncentráció max. 55 M (c H2O vízben)

6 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Entrópia tényező AB A + B CAB ‡ C 2. 1. 1M A; 1M Bv A+B ~ 55 v wat oldószer-üreg: ~ 6 v wat k cat, AB / k cat, A+B < 10

7 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése valódi entrópia tényező alapállapotú konfiguráció entrópiacsökkenése felt.

8 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése valódi entrópia tényező mivel az enzim flexibilis, nagy (NMA, QHA =20-200 cm -1 ) azok a szabadsági fokok számítanak, melyek az átmeneti állapotban csökkennek kiszámítható (két PES összehasonlítása gázfázisban) az entrópiacsökkenés miatt ~ 1 kcal/mol „orbital steering” szintén kicsi effektus

9 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) A katalízis hajtóereje, hogy ez enzim a kindulási anyagok geometriáját destabilizálja és az átmeneti állapothoz hasonlóvá teszi (feszültség) TS R P Reakciókoordináta Energia w p

10 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) TS: sofa konformáció Alapállapot enzimben: sofa konformáció csökken Lizozim ( oligoszacharidok hidrolízisét katalizálja) ROR’+ AH ROH + R’+A - R + +A - + R’OH ROH + AH +R’OH

11 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) model: 1. enzim + szék konformációjú szubsztrát 2. enzim + sofa szubsztrát kiszámítása: alapáll. enzim víz

12 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Sztérikus feszültség (Steric strain hypothesis) Miért kicsi a fehérjében a feszültség? MM model fehérje szubsztrát fehérje 1 Å változás a szubsztrátban k cat (p) /k cat (w)~ 150 felső becslés k=30 kcal/mol Å 2 5 kötésre tevődik át a fehérjében (0.2 Å kötésenként)

13 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) az enzim a reaktánsok konfigurációs terét úgy csökkenti le, hogy ideális legyen a reakcióhoz TS R P Reakciókoordináta Energia w p

14 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) Haloalkán dehalogenáz (DHlA) GS S N 2 reakció TS Shurki és Warshel (2001) J. Am. Chem. Soc. 124, pp. 4097-4107

15 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) Haloalkán dehalogenáz (DHlA) pontosan definiálni kell! 1. MD szimuláció kényszerfeltétellel, majd elengedve a kényszert 2. MD szimuláció elektrosztatika nélkül (csak sztérikus effektusok)

16 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Near Attack Conformation (NAC hypothesis) sztérikus eff. 2.2 kcal/mol, de ebből 1.5 kcal/mol elektrosztatikus hatás

17 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Dinamikus effektusok speciális fluktuációk lecsökkentik a TS régióban töltött időt k kiszámítható, hogy a trajektóriák mekkora része visz át a TS régión

18 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Dinamikus effektusok „lineáris válasz közelítésben” Q: általános koordináta, oldószer hozzájárulása a  j (t)-  i (t) energiakülönbséghez  : oldott anyag dipólusmomentuma  10 -12 – 10 -13 között változik k cat : max. 10-szeres változás

19 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Kvantum effektusok (tunneling) átmeneti állapot meghatározása TS elmozdítása a nyeregpontból a r.k. mentén TS optimálása a reakciósebesség számításával Cui és Karplus (2002) J. Am. Chem. Soc. 124, pp.3093-3124 Variational transition state theory (VTST) kvantum effektusok mennyire járulnak hozzá az energiagát csökkentéséhez viszonylag kis effektus, ~10-100 szoros gyorsítás

20 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Kvantum effektusok (tunneling) Csak megfelelő referenciarendszer esetén van értelme! Meg kell vizsgálni az oldatfázisú reakciót is, és a kísérleti k cat értékekhez kell viszonyítani

21 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Deszolvatáció Nem poláros aktív helyek azzal segítik a katalízist, hogy deszolvatálják a reaktánsokat, ezzel hasonlóvá teszik a gázfázishoz. TS G.S. P Reakciókoordináta Energia w p

22 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Lee és Houk (1997) Science 92, pp. 942-945 Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció (k cat /K M )/k non ~ 10 23 „a leghatékonyabb enzim” k cat /k w ~ 10 17

23 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Lee és Houk (1997) Science 92, pp. 942-945 Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció Ab initio számítások gázfázisban (MP2/6-31+G*) protonáltsági állapotok tesztelése (gázfázisú protonaffinitások) környezet figyelembe vétele makroszkópikusan reprodukálják a sebességnövekedést gázfázis vs. oldatfázis ODCase fő katalitikus eleme: az alacsony dielektromos állandójú környezet, mely hasonlóvá teszi a reakciót a gázfázisúhoz

24 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Lee és Houk (1997) Science 92, pp. 942-945 Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció

25 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Florian és Warshel (1998) PNAS USA 95, pp. 5950-5955. Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció

26 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Warshel és mtsai (2000) Biochemistry USA 39, pp. 14728-14738. Orotidin Monofoszfát dekarboxiláz Deszolvatáció Asp-70 és Asp-75 pre-organizált környezet célja: TS stabilizáció és NEM G.S. destabilizáció

27 Észter hidrolízis  g desolv G.S. T.S. T.I. apoláros aktív hely poláros aktív hely

28 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Acetilkolin-észteráz Hipotézis: aromás oldalláncok szerepe a gázfázis-szerű környezet kialakítása átmeneti állapot stabilizációjának számítása apoláros enzimben (PDLD/LRA számítás, geometria EVB-FEP/US alapján) destabilizálásantikatalízis

29 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Low Barrier Hydrogen Bond (LBHB) katalitikus hidrogénkötéseknek egy energiaminimuma van (ionos HB) Hipotézis: alacsony aktiválási energiával létrejövő, kovalens jellegű hidrogénkötések segítik a katalízist EE d d O-H....O O...H....O H 1 és H 2 dominál H 12 dominál

30 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Low Barrier Hydrogen Bond (LBHB) Kiszámítható: FEP módszerrel „Kötési energia” számítással (re-organizáció, LRA) Az eredményeknek összhangban kell lenniük pKa számítások eredményeivel. LBHB apoláros környezetben jelentős effektus, polárosban nem.

31 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Acetilkolin-észteráz TS stabilizáció

32 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése : reorganizációs energia Acetilkolin-észteráz

33 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése aktiválási energia csökkenése reorganizációs effektussal Acetilkolin-észteráz aktiválási energia csökkenése reorganizációs effektussal 10 kcal/mol a 15 kcal/mol-ból (10 7 faktor a 10 11 -szeres sebességnövekedésből (k cat (p) /k cat (w)) legjelentősebb effektus

34 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése Re-organizáció: a fehérje dipólusai úgy állnak, hogy stabilizálják a reakció átmeneti állapotát Acetilkolin-észteráz Hogyan valósul meg? Gly-118, Gly-119, Ala-201 főlánc hidrogénkötések az acetilkolin karbonil oxigénjéhez (hipotetikus kötődési modell, csoporthozzájárulások számítása)

35 Enzimreakciók Enzimatikus katalízis értelmezése A fehérjék úgy evolválódtak, hogy a feltekeredett fehérje aminosavainak dipólusai tökéletes szolvatációt biztosítsanak a katalizált reakció átmeneti állapotának. Mivel pre-orientált dipólusok elrendeződése megfelel a reakció átmeneti állapotának, az enzimkörnyezet kis átalakuláson megy keresztül míg a reakció a reaktánsoktól a végállapotba jut. Ezért az enzimatikus effektus elektrosztatikus hatásokon keresztül fejeződik ki, mely az „oldott anyag” és a fehérje állandó dipólusai között jön létre. A dipólusok megfelelő elrendeződéséhez szükséges energia a feltekeredés során fektetődik be. Az enzimek tehát az általuk katalizált reakció „szuper-oldószerei”, mely a TS állapotnak komplementer környezetet biztosít. Annak ellenére, hogy néhány oldallánc kiemelkedő hozzájárulást ad a reakció energiagátjának csökkentéséhez, az aktiválási energia csökkentése nem bontható egyszerűen komponensekre.