Kvantitatív élelmiszermikrobiológiai vizsgálati módszerek

Az előadások a következő témára: "Kvantitatív élelmiszermikrobiológiai vizsgálati módszerek"— Előadás másolata:

1 Kvantitatív élelmiszermikrobiológiai vizsgálati módszerek
Gyakran olyan hallgatóságnak kell szakmai előadást tartani, amely nem ismeri a témát vagy a szakszavakat. Az anyag esetleg összetett és rengeteg adatot tartalmaz. A hatékony előadáshoz alkalmazzuk a Dale Carnegie Training® által kialakított irányelveket. Vegyük figyelembe a rendelkezésre álló időt és rendszerezzük megfelelően a tananyagot. Szűkítsük le a témakört. Osszuk fel a bemutatót világosan elkülönített részekre. Állítsunk fel logikus sorrendet. Végig egy témára összpontosítsunk. A bemutatót összefoglalással zárjuk, ismételjük meg a fontos lépéseket vagy vonjunk le következtetést. Ne feledkezzünk el a hallgatóságról. Fontos például, hogy az adatok érthetőek és lényegesek legyenek a téma szempontjából. Az adatok és a szakszavak mennyiségét igazítsuk a hallgatósághoz. A fontosabb pontok és lépések magyarázatához használjunk szemléltetőeszközöket. Mindig tartsuk szem előtt a hallgatóság igényeit, és akkor képesebbek lesznek az elhangzottak befogadására.

2 A kvantitatív vizsgálati módszerek csoportosítás
Direkt sejtszám meghatározás Cél: összes csíraszám meghatározása Módszer: mikroszkópos Hiba: sejtek aggregátumokba tömörülnek, nem tesz különbséget élő és elhalt sejtek között Indirekt sejtszám meghatározás Módszer: optikai, tömegméréses, kémiai Cél: összes élőcsíraszám meghatározása Módszer: tenyésztéses A bevezető mondatokban ismertessük a téma fontosságát a hallgatóság számára. Nyújtsunk rövid betekintést a bemutatóba és érzékeltessük a hallgatósággal az értékét. Vegyük figyelembe a hallgatóság érdeklődését és a témával kapcsolatos szaktudását a nyelvezet, a példák és a szemléltetés megválasztásában. Összpontosítsunk arra, hogy mennyire fontos a téma a hallgatóság számára, és akkor jobban oda fognak figyelni.

3 1. Tenyésztéses módszerek
Speciális utalás Élő, szaporodásra képes Szilárd tápközegen telep Folyékony tápközegben zavarosság Mérhető anyagcseretermék-képzés Egységes, standardizált módszerek alkalmazása Univerzális tápközeg nincs Különböző igény a szaporodási feltételek iránt Pipettázási hibák befolyása az eredményre jelentős (!min. 10%!) Ha több pontot, lépést vagy ötletet tárgyalunk, használjunk több diát. Döntsük el, hogy mi a hallgatóság feladata: egy új ötlet megismerése, egy folyamat megértése vagy nagyobb elmélyedés egy ismerős témában. Lássuk el megfelelő magyarázattal az egyes pontokat. A bemutatót támaszuk alá szakmai adatokkal, amely lehet könyv, vagy lemezen tárolt anyag, elektronikus üzenet vagy Interneten található adatok. Az egyes pontokat a hallgatósággal folytatott beszélgetés és visszajelzések mellett fejtsünk ki.

4 1.1. Telepszámlálásos eljárások (CFU,KBE)
Pontosság párhuzamosok és/vagy ismétlés Feldolgozás 30 percen belül Azonos tenyésztési feltételek: Előkészítés táptalaj mennyiség/lemez vízszintes szilárdulás Inkubálás max. 6 lemez egymáson páratartalom/tömegvesztés (48h<15%) Leolvasás mintamaradványok lupe, sztereomikroszkóp Határozzuk meg a legjobb lezárási módot mind a hallgatóság, mind a bemutató szempontjából. Fejezzük be összefoglalással; ajánlunk fel egyéb lehetőségeket; javasoljunk egy stratégiát; javasoljunk egy tervet; tűzzünk ki egy célt. Tartsuk magunkat végig a bemutatóban kitűzött célunkhoz, és akkor valószínűleg elérjük azt.

5 1.1.1. Lemezöntéses módszer Folyamata Decimális hígítási sor készítése
Egyértelmű jelzéssel ellátott petri-csésze 1-1 ml szuszpenziót pipettázunk Steril, °C-os táptalajból ml kerül minden Petri-csészébe Alapos keverés óvatos mozgatással Megfordítani a Petri-csészéket (szilárdulás után) Inkubálás (T, t) Telepszámlálás

6 A csíraszám számítása Csak azokat a lemezeket vonjuk be az értékelésbe, amelyeken a telepszám (nagyméretű telepek esetén ) közötti. A csíraszámot az értékelésbe bevont lemezeken megszámlált telepszámok súlyozott átlagaként adjuk meg a hígítási fok figyelembe vételével az alábbi képlet alapján: ċ=telepszám súlyozott középértéke Σc=a számításba bevont valamennyi lemez telepeinek összege (legalacsonyabb és az azt követő kiértékelhető hígítási fokok) n1=a legalacsonyabb kiértékelhető higítási fokhoz tartozó lemezek száma n2=a következő kiértékelhető higítási fokhoz tartozó lemezek száma d=a legkisebb kiértékelt hígítási szint hígítási faktora A kapott értéket minden esetben normál alakba hozva adjuk meg eredményként. Ennél a vizsgálati módszernél célszerű az alkalmazott táptalajt úgy megválasztani, hogy az tiszta, áttetsző legyen, mert az opálos színű táptalajok zavarhatják a kolóniák felismerhetőségét.

7 1.1.2. Felületi szélesztéses módszer
Folyamata Előre leöntött, megszilárdult, szikkasztott felületű lemez (szárítás-nyitott 50 °C –30perc-zárt 37 °C-4 h v. 50 °C-2h) A felületre hígításonként 0,1 ml szuszpenziót pipettázunk (párhuzamosan!) Egyenletes szélesztés steril üvegbottal v. kis kémcső gömbölyű végével. Inkubálás (T, t) Telepszámlálás

8 A csíraszám számítása ċ=telepszám súlyozott középértéke
Σc=a számításba bevont valamennyi lemez telepeinek összege (legalacsonyabb és az azt követő kiértékelhető hígítási fokok) n1=a legalacsonyabb kiértékelhető higítási fokhoz tartozó lemezek száma n2=a következő kiértékelhető higítási fokhoz tartozó lemezek száma d=a legkisebb kiértékelt hígítási szint hígítási faktora

9 Membránszűrés Univerzális eljárás, mert alkalmas mennyiségi és minőségi vizsgálatokra is. A membránszűréses módszert alacsony csíraszámú folyadék- és gázminták vizsgálatára alkalmazzuk. A minta meghatározott mennyiségét membránfilteren átszívatva annak pórusain a mikrobák visszamaradnak. A membránfiltert táptalajra helyezve a filteren átdiffundáló tápanyagok révén a telepek magán a filteren alakulnak ki.

10 1.2. Határhígításos eljárás I.= Most Probable Number (MPN)
Alkalmazhatóságnak alapfeltétele: a sejtek eloszlása az alapszuszpenzióban véletlenszerű legyen, vagyis a sejtek a szuszpenzió bármely részében azonos valószínűséggel legyenek megtalálhatók A folyékony táptalajban mikrobaszaporodás legyen tapasztalható már 1 élő sejtet tartalmazó inokulum beoltása esetén is. Pontosság növelése: hígítási arány csökkentése párhuzamosok ismétlés

11 Határhígításos módszer II.
Folyamata Alapszuszpenziót készíteni és decimális alapon addig hígítani, míg az utolsó hígítás 1 ml-ében már valószínűleg már nem található a keresendő mikroorganizmus egyetlen sejtje sem. A hígításokból steril pipettával 1-1 ml-t kioltunk folyékony táptalajt tartalmazó csövekbe. A megkívánt pontosságtól függően hígításonként 2-2, 3-3, 4-4 vagy 5-5 párhuzamos leoltást végzünk. Inkubálás (T, t) A szaporodást mutató csövek számának és hígítási szintjének ismeretében a Hoskins-féle táblázatokban a kulcsszám segítségével meghatározzuk a legvalószínűbb élősejtszámot.

12 Hoskins-féle táblázat a cm3-enkénti élősejtszám megállapításához hígításonként 3-3 leoltás esetén
Kulcsszám Alapérték 000 100 110 111 200 210 211 220 221 222 0.36 0.73 1.1 0.91 1.5 2.0 2.1 2.8 3.5 300 310 311 320 321 322 330 331 332 333 2.3 4.3 7.5 9.3 15 21 24 46 Tovább higítani!

13 Összcsíraszám meghatározás
Mezofil aerob csíraszám: azon mikroorganizmusok telepképző egységeinek száma, amelyek PC-agarral öntött lemezen 30°C-on, 72 órán át aerob körülmények között inkubálva makroszkóposan számlálható telepeket képeznek. Plate Count Agar Összetétel: Tripton 5,0 g Élesztőkivonat 2,5 g Glükóz 1,0 g Agar agar 9,0 g Jellemzők: pH: 7,2±0,2 Szín: tiszta, áttetsző sárgás Állag: szilárd

14 Spórás baktériumok számának meghatározása
Különböző hőkezelések hatására a vegetatív baktériumsejtek jelentős része elpusztul, míg a spórás baktériumok megőrizhetik életképességüket. Kimutatás elve: A terméket percig 80 °C-on kezelve elpusztulnak a vegetatív sejtek, s a spórás baktériumokat optimális körülmények közé helyezve (tápközeg, hőmérséklet) kitenyésztjük és számukat a szokásos sejtszámolási módszerrel meghatározzuk. Jól reprodukálható eredmény eléréséhez hígítószerként olykor „életrekeltő” folyadékot alkalmazunk, ami 0,1%peptont tartalamazó fiziológiás sóoldat. A konzervek gyártásánál, gyümölcs és zöldségszárítmányok készítésénél alkalmazott különböző hőkezelések (sterilezés, blansírozás, szárítás) hatására a vegetatív baktériumsejtek jelentős része elpusztul, míg a spórás baktériumok megőrizhetik életképességüket.

15 Spórás baktériumok számának meghatározása
Aerob spóraszám: azon mikroorganizmusok telepképző egységeinek száma, amelyek 80 °C-os hőkezelést követően PC-agarral öntött lemezen 30°C-on, 72 órán át aerob körülmények között inkubálva makroszkóposan számlálható telepeket képeznek. Anaerob spóraszám: azon mikroorganizmusok telepképző egységeinek száma, amelyek 80 °C-os hőkezelést követően PC-agarral öntött lemezen 30°C-on, 72 órán át aerob körülmények között inkubálva makroszkóposan számlálható telepeket képeznek.

16 Penész- és élesztőgombák számának meghatározása
Növényi termékeink természetes mikroflórájának igen gyakori képviselői az élesztő- és penészgombák, hiszen minden anyagot tartalmaznak Mikróbák száma függ: érettség fokától (pl. túlérés) szállítás körülményeitől (nagy távolságra, hőség) hosszan tartó, nem megfelelő tárolás feldolgozási folyamat alatti leállások, nem kielégítő technológia (válogatás, mosás) A penész- és élesztőgombák benn maradhatnak a félkész, vagy kész termékben, ahol romlást okoznak (erjesztés, penészedés), vagy az egészségre káros anyagokat termelhetnek (pl. mikotoxinokat). Mennyiségi kimutatásuk kis pH-ra beállított táptalajokon (pH 3,5- 4), lemezöntéssel vagy szélesztéses módszerrel történik. Minden anyag: anyagcserefolyamathoz, szaporodáshoz) Mint: C, N-forrás, vitamin, ásványi sók Penészgombaszám meghatározás fűszerpaprikából Élesztőgombák számának meghatározása üdítőitalból (az üdítőitalok romlásának 90%át élesztőgombák okozzák).

17 Kvalitatív élelmiszer-mikrobiológiai vizsgálati módszerek

18 A kvalitatív vizsgálati módszerek
Jelenlét igen/nem, ha igen identifikálás Dúsítás- revitalizálás, arány növelés Elektív, szelektív, differenciáló tápközegek Speciális tenyésztési paraméterek Izolálás - lemezöntés Tiszta tenyészet - szélesztés előállítása

19 Identifikálás Morfológiai vizsgálatok
Mikromorfológiai (sejtmorfológia)- alak, méret, mozgásképesség, festhetőség, tok, spóra, sejtosztódás, sejtcsoportosulás Makromorfológiai- folyékony és szilárd táptalajokban létrehozott tenyészet alaktani vizsgálata Mikroorganizmusok szaporodására ható környezeti tényezők Speciális anyagcseretermékek kimutatása (pl. kataláz, oxidáz, indol, koaguláz, thermonukleáz, zselatin elfolyósítás, NO3, O/F teszt, Ureáz, VP próba, hemolízis stb.) Antigénszerkezetet elemző szerológiai vizsg. Genetikai tesztek

20 Optikai módszer Tömegmérés Kémiai módszer
Kalibrációs görbe (nem lineáris) - fotométer Nefelometria- <106 sejt/ml – fényszóródás Turbidimetria- > 106 sejt/ml – fényelnyelés Tömegmérés Sejttömeg meghatározás (szűrés, centrifugálás, szárítás, mérlegelés) Kalibrációs görbe (nem lineáris) Kémiai módszer pl. sav-lúgképzés mérése, összes N meghatározása

21 Mikroszkópos módszer Min. 105 /ml sejtszám Gyors, konzerválható
Számlálókamrás eljárások Definiált térfogat hálózatbeosztás Szorzófaktor Pontosság összes megszámolt sejt/számláláshoz igénybevett négyzetek száma THOMA-, BÜRKER-KAMRA Festéses eljárások Adott mintamennyiség Adott terület Látótérátmérő ill. –terület BREED- FÉLE