A génexpresszió szabályozása

Az előadások a következő témára: "A génexpresszió szabályozása"— Előadás másolata:

1 A génexpresszió szabályozása
A molekuláris biológia centrális dogmája: transzkripció transzláció DNS RNS Fehérje Reverz transzkriptáz Génexpresszió: a gén kifejeződése Bakteriális genom: néhány millió bázispár Humán genom: bázispár Önmagában értelmetlen adathalmaz. Mikor, milyen körülmények között készül az adott gén terméke, ha elkészül milyen szerepet lát el?

2 Különböző sejttípusok: szerkezeti és funkcionális különbségek
Sejtdifferenciáció Különböző sejttípusok: szerkezeti és funkcionális különbségek A sejtdifferenciáció gyakran irreverzibilis A differenciálódott sejtek genetikai állománya szelektíven elvész NEM IGAZ Génállományuk mégis azonos. Sejtdifferenciáció: a génexpresszió megváltozása A sejtfajták különbségének oka: a különböző RNS és fehérje állomány.

3 Bizonyíték a differenciálódott sejtek azonos genetikai hátterére

4 Azonosságok és különbségek a sejtek között
1. Sok folyamat van, ami közös a különböző típusú sejtekben, ezek közös fehérjehátteret jelenthetnek 2. Sok fehérje csak az adott sejttípusban található meg pl.: hemoglobin a vörösvértestben 3. Egy adott időben egy átlagos humán sejt génje közül mintegy fejez ki. A különböző gének kifejeződési mintázata nagy fokú variációt mutat. 4. A különböző sejttípusok mRNS-beli különbségét messze meghaladja a fehérjéikben manifesztálódó különbségek, melynek okát többek között az alternatív splicingban, különböző poszttranszlációs módosulásokban kereshetjük. A legtöbb sejt képes külsődleges szignálokra megváltoztatni génkifejezési mintázatát

5 A génkifejeződés szabályozásának szintjei
sejtmag citoszol inaktív mRNS 5 1 2 DNS RNS mRNS mRNS transzkript 3 4 fehérje 1. transzkripciós kontroll 2. RNS érési kontroll 3. RNS transzport és lokalizációs kontroll 4. Transzlációs kontroll 5. RNS degradációs kontroll 6. Fehérje aktivációs kontroll 6 inaktív fehérje A transzkripciós kontroll kiemelkedő fontosságú

6 A DNS-hez kötődő génszabályozó fehérjék
Hogy dönti el a sejt, hogy a több ezer génje közül melyik kerüljön átírásra? Az átírni kívánt génszakasz közelében található egy gén regulációs szakasz: egyszerübb, mint egy szimpla kapcsoló mikroprocesszor bonyolúltságú Mindkét típús két fő egységből áll: rövid irányító DNS szakasz gén regulációs fehérje, melyek az előbbiekhez kötnek Az elsőként felfedezett ilyen fehérje a l-represszor volt.

7 A felismerés alapja Első gondolat: a fehérjék a bázisok közötti H-hidakat ismerik fel. NEM Az azonosítás alapja a DNS külső felszíne. Nem kell a DNS kettős szálnak ketekerednie. Mindegyik bázispár éle a DNS kettős hélix felületén van - H-kötés donorok - H-kötés akceptorok - hidrofób csoportok a megfeleltetés alapjai

8 A DNS kettős hélix szerkezete
kis árok nagy árok A fehérjék számára csak a nagy árokban áll rendelkezésre elegendő információ a megfelelően biztos szerkezetfelimeréshez. nagy árok kis árok

9 A DNS kitekerése nélkül, a kettős hélix élein található csoportokkal azonosítható
A DNS azonosítási kódja. A nagy árok egyedi megfeleltetést tesz lehetővé.

10 A DNS kettős hélix torzulásai is mind megfeleltetési alapok. Pl
A DNS kettős hélix torzulásai is mind megfeleltetési alapok. Pl.: sok AAAA kanyarulatot visz a DNS láncába. A DNS szerkezete is bizonyos mértékig változik, illeszkedik a fehérje bekötődésével. A genetikai kapcsolók fontos részei ezek a 20 bp-nál rövidebb DNS szekvenciák. Több ezret azonosítottak ezidáig. Az E. coli CAP fehérjéjének bekötődésére kialakult DNS szerkezetváltozás (a CAP fehérje nélkül egyenes szálú a DNS)

11 Génfelismerő fehérje szerkezeti egységek
A biológiában a molekuláris felismerés a két molekula felületének tökéletes illeszkedésén múlik. A féhérje felülete nagy mértékben komplementer a kettős hélix adott régiójának felületi sajátságaival. A DNS felismerő fehérjék mindegyike tartalmaz egy specfikus DNS kötő szakaszt (rendszerint a-hélix, b-redő) hidrofób ionos H-híd kötődések A kapcsolódások mindegyike egyedi, egyenként gyengék, de kapcsolódás erős specifikus kötődést erdeményez.

12 Néhány gén-regulációs fehérje és az általuk felismert DNS szekvencia

13 Hélix-Turn-Hélix fehérjék
Az elsőként leírt DNS-kötő fehérje. Bakteriális és eukarióta sejtekben előforduló, több száz tagú fehérjecsalád. C-terminális hélix: DNS felismerő N-terminális hélix: szerkezeti feladatok A szerkezeten kívül eső részek nagyon változatosak Dimerként kötnek a DNS-hez

14 Homeodomén fehérjecsalád
Elsőként drosophilában fedezték fel, magasabbrendű élőlényekben is kulcsszereppel bírnak. Mindegyikük tartalmaz egy nagy homológával bíró 60 aminosavnyi részletet a homeodomént. Háromdimenziós szerkezetében hélix-turn-hélix részletet talmaz. Szinte minden élőlényben leírták már pl.: élesztő, növény, ember Esetükben a h-t-h részlet környezete is hasonló térszerkezetű, az alacsony aminosavazonosság elenére

15 Cink-ujj fehérjék h-t-h: csak aminosav rézletekből áll cinkujj fehérjék: egy vagy több szerkezeti feladatot betöltő Zn Mindegyik Zn tartalmú DNS kötő fehérjét így hívják az első felfedezett Zn ujj fehérje alakja nyomán, amely az eukarióta rRNS expressziójának aktiválásáért felelős. Egy a-hélix és egy b-redő, amelyet egy Zn tart össze.

16 Gyakran klasztereket alkotnak, folyamatosan kitöltva a nagy árkot
Gyakran klasztereket alkotnak, folyamatosan kitöltva a nagy árkot. Erős specifikus DNS-fehérje kötődés. Az ismétlődések számával szabályozható a kötődés erőssége

17 Cinkujj fehérjék másik családja az intracelluláris receptorokban található.
Két a-hélix pakolódik össze egy Zn segítségével hasonló a h-th-hez, dimereket képez az egyik a-hélix fekszik be a nagy árokba A két család közös vonása: - Zn szerkezeti elem - a-hélix ismeri fel a nagy árokban a jellegzetes DNS szekvenciát

18 DNS felismerő b-redő részletek
A b-redő részletek is képesek DNS felismerésére Az aminosav oldalláncok a DNS irányába lógnak a vázról.

19 Leucin zippzár Sok gén-regulációs fehérje homodimer, gyakran a dimerizálódásért felelős rész más, mint a DNS kötésért felelős rész. A Leucin zippzár ötvözi a két funkciót. Két a-hélix hidrofób kötésekkel (általában leucin részleteknél) összecsavarodnak. Képes heterodimereket is alkotni

20 Kombinatórikus kontroll: nem egy önálló fehérje, hanem különböző fehérjék kombinációja felügyeli a sejt folyamatait.

21 Hélix-loop-hélix fehérjék
Egy rövidebb és egy hosszabb a-hélix szakaszból és az őket összekötő szakaszból áll. Flexibilis hurok: a két hélix egymással átellenben áll. Ez a h-l-h szerkezet a DNS-hez kapcslódik, valamint a leucin zippzarhoz hasonlóan egy másik h-l-h szerkezethez. Előszeretettel alkotnak homo- és heterodimereket Csonka h-l-h szerkezetek, heterodemereket alkotnak. Szabályozási lehetőség

22 Melyik fehérjedarab melyik DNS szakaszt ismeri fel?
Létezik-e pontos aminosav-bázis megfeleltetés? Nem. Bár egyes bázis-aminosav párosítások gyakoribbak, mint mások. A fehérjék 20 aminosavból kombinálódnak, így több lehetéséget is kapnak, hogy az adott szekvenciának megfelelő felületet kialakítsák.

23 A génexpresszió szabályozása - a genetikai kapcsolók munka közben
E. coli genom: 4,6 millió bázispár (4300 fehérje) Sok fehérje átírása a rendelkezésre álló táplálékoktól függ. Triptofán operon: Az 5 gén egyetlen promóterről iródik át Ha a triptofán készen rendelkezésre áll a szintézis génjeit kikapcsolja

24 A promóter szerepe a transzkripciós szabályozásban
A transzkripció iniciációja kiemelt fontosságú: melyik fehérjét és milyen arányban fejezi ki a sejt Bakteriális RNS polimeráz: több alegységes komplex. Különálló alegység, a s faktor felelős a DNS-en a transzkripció kezdőhelyét jelentő szignál felismeréséért. Az RNS polimeráz gyorsan végigszánkázik a DNS-en, ha azonban a polimeráz a promóter régióra csúszik szorosan hozzáköt. s faktor: a felismerő

25 A triptofán operon Operátor szekvencia: promóterben található egy szabályozó DNS szakasz. Egy gén szabályzó fehérje, a triptofán represszor kötődhet hozzá. Triptofán represszor: hélix-turn-hélix Ha a triptofán represszor beköt megakadályozza a z RNS polimeráz bekötődését a promóterhez.

26 A triptofán represszor operátorhoz kötődéséhez, magának is két triptofánt kell kötnie.
A fehérje aktív, DNS kötő formája kikapcsolja a gént negatív kontroll a fehérje: transzkripciós vagy gén represszor fehérje

27 Transzkripciós vagy gén aktívátor fehérjék
Néhány bakteriális promöter szekvencia hatásfoka alacsony, mivel: 1. Az RNS polimeráz csak alacsony hatásfokkal ismeri fel 2. Az RNS polimeráznak nehézségei adódnak a DNS kettős hélix felnyitásával és a transzkripció megindításával. Ezen fehérjéknek a promóterhez kapcsolódó gén regulációs fehérje mentővet dobhat. Ezen fehérjék aktív, DNS kötő alakja bekapcsolja a gént pozitív kontroll a fehérje: transzkripciós, vagy gén aktívátor fehérje

28 Lehetséges mechanizmusok:
segítenek a polimeráz promóterhez kötődésében, egy újabb kapcsolódó felület létrehozásával a polimeráz transzkripciós állapotba alakulását segítik a DNS -kötő és a transzkripciós állapot közötti átmeneti állapot stabilizálásával Példa a pozitív kontrollra: katabilit aktívátor fehérje (CAP) CAP: képessé teszi az E. colit (különböző gének bekapcsolása által) az alternatív szénforrások felhasználására, ha a preferált szénforrása a glukóz nem áll rendelkezésére

29 Glukóz szint csökken cAMP szint emelkedik a cAMP és a CAP egymához kötődnek a CAP specifikus DNS szakaszokhoz kötődik Bekapcsolja a célgént

30 Sok esetben hasonló a represszor és az aktívátor felépítése pl
Sok esetben hasonló a represszor és az aktívátor felépítése pl.: CAP és a triptofán represszor is h-t-h részleteket tartalmaz és egy kis kofaktort igényelnek a DNS-hez kötődéshez. Néhány bakteriális fehérje (CAP, bakteriofág l-represszor) mind represszorként, mind aktívátorként képes viselkedni. A döntő, hogy az általuk felismert DNS szekvencia hogyan helyezkedik el a promóterhez képest.

31 A pozitív és a negatív szabályozás kombinációja: lac operon
lac operon: laktóz sejtbe jutását lebontását katalizáló enzimek/fehérjék CAP: alternatív szén/energiaforrások felhasználása (pl.: laktóz) ha nincs jelen glukóz. Azonban veszteség lenne laktóz távollétében is expresszálni a metabolizmusához szükséges fehérjéket lac represszor 2 szignál integrálása: a lac operon magas szinten csak akkor expresszál: - ha nincs jelen glukóz - és a laktóz jelen van

32 Minden más esetben a gén ki van kapcsolva
laktóz glukóz adagolás allolaktóz szint növekedése hozzáköt a represszorhoz eltávolítja a DNS-ről cAMP szint csökkenése cAMP nem tud a CAP-hez kötni CAP leválik a DNS-ről gén bekapcsolása gén kikapcsolása

33 Prokarióta génregulációs fehérjék működési mechanizmusa

34 Az eukarióta génexpresszió szabályozása
Bakteriális rendszer: egyszerű, de erősen limitált képességek, szignálok tucatjainak kezelésére képtelen. A promóter szomszédsága szűkös. Az eukarióta transzkripciós szabályozás 3 fő részletben is eltér a prokariótákétól: 1. Távolsági génreguláció 2. Az RNS polimeráz II általános transzkripciós faktorokat igényel a transzkripció inicációjához (jó szabályozási lehetőség) 3. Az eukarióta DNS kromatinba csomagolódik

35 Eukarióta génregulációs fehérjék
aktívátorok, represszorok Enhancerek: DNS szakaszok, melyekhez a regulációs fehérjék kötnek. az aktívátor fehérje akár több ezer bp távolságra lehet - hatását a génhez viszonyított helzyzetétől (downstream, vagy upstream) függetlenül kifejti Hogy képes így a promóterrel kommunikálni? A DNS egy hurkot formál az enhancer és a promóter szakaszok között. A két részhez kötődött fehérjék így kapcsolatot teremthetnek

36 Baktériumokban is előfordul, csak sokkal ritkább és sokkal rövidebb

37 Eukarióta DNS regulációs szekvenciák
Génregulációs régió: - promóter (RNS polimeráz, általános transzkripciós faktorok) - regulációs szekvenciák (regulációs fehérjék) A két részlet távolsága akár bp is lehet - nukleoszómákba pakolódik, lecsökkentve a távolságot - flexibilis DNS szakasz segíti a promóter és az enhancer összehajlását

38 Általános transzkripciós faktorok: nagy mennyiségben előforduló, kis változatosságot mutató fehérjék (konzervatívak is). Gén regulációs fehérjék: több ezer fajta, a humán gén 5-10 %-a ezeket kódolja, nagy változatosság, kis mennyiségben fordulnak elő, DNS felismerés vagy más felismerő fehérjék felépítése Egy organizmus önálló génjeit kapcsolják be- vagy ki. A génregulációs fehérjék egyedi összeállítását tartalmazzák a különböző sejttípusok. ezáltal a génexpressziós mintázatuk is egyedi lesz különböző sejttípusok eltérő sajátsága

39 Génaktívátor fehérjék és a transzkripció
Moduláris felépítésüek: 2 fő domén - DNS felismerő részlet - aktivációs domén (transzkripció gyorsítása) Moduláris szerkezet leírása hibrid fehérje segítségével: egyik fehérje DNS felismerő része, egymásik fehérje aktívációs részével egyesítve

40 Génaktívátor fehérjék működése
- vonza - pozicionálja - módosítja Az általános transzkripciós faktorokat és az RNS polimeráz II-t a promóteren transzkripció Direkt módon vagy a kromatin szerkezetét változtatják meg 1. direkt hatás Sok aktívátor fehérje kölcsönhat a holoenzim komplexxel energetikailag még alkalmassabbá téve a promóterhez kötődésre. Az aktívátorok kvázi vonzák a holoenzimet

41 Alátámasztó kísérlet:
Szekvenciaspecifikus részletet fúzionáltattak közvetlenül a mediátorhoz. Az aktívációs részlet hiányzott a hibridből, mégis jelentős mértékben elősegítette a transzkripció megindulasát Más aktívációs módszerek 1. Általános transzkripciós faktorok lépésenkénti összeszerelése a promóteren 2. A megkötődést követő átrendeződések egítése 3. Kiemelt általános transzkripciós faktorok (TFIID, TFIIA) promóteren történő beszerelése

42 A lokális kromatin szerkezet megváltoztatása
Regulációs és promóter részletek - kovalens hisztonmódósítása - nukleoszóma remodellezése Sok génregulációs fehérje mindkét módszert használja a: - hiszton acetiltranszferáz - ATP- ependens kromatin remodellező komplex megkötése, rekreálása révén. A kromatinszerkezet vátozása nagyobb hozzáférhetőséget biztosít az alapjául szolgáló DNS-hez

43 Ez lehet a bazális transzkripció iniciáció gátlásának oka
Az általános transzkripciós faktorok nem képesek a konvencionálisan pakolt promóteren összeállni. Ez lehet a bazális transzkripció iniciáció gátlásának oka A transzkripciósan aktív kromatin esetében a hiszton acetiláció jellegzetes formája figyelhető meg 1. Jobban hozzáférhető 2. Jellegzetes (szignálszerű) acetilációs mintázat Ezt az acetilációs mintázatot ismeri fel a TFIID általános transzkripciós faktor egyik alegysége

44 A génregulációs fehérjék szinergetikusan dolgoznak
Több különböző lépést képesek befolyásolni Ha több faktor hat egyszerre az összhatás nem szimplán a külön-külön ható faktorok hatásának összege, hanem jóval nagyobb annál. A faktor: 1x energiagátcsökkentés x reakciósebességnövekedés B faktor: 1x energiagátcsökkentés x reakciósebességnövekedés A és B faktor: 2x energiagátcsökkentés x reakciósebesség-növekedés

45 Eukarióta represszorok
heteorokromatin: a kromatin transzkripciórezisztens formája

46 Az eukarióta gén regulációs fehérjék komplexet alkotnak a DNS-en
Legtöbbjük, mint több alegységből álló komplex hat. Gyakran csak a megfelelő DNS szekvencia jelenlétében állnak össze. Két egymás iránt kis affinitást mutató feérje köthet a DNS-hez amihez külön-külön nem rendelkeznek elegendő affinitással. Ehhez a dimerhez köthet egy harmadik aktivációs domént hordozó regulátor fehérje. A DNS kvázi kristályosodási gócként, összeszerelési mag szerepel. Egy adott regulációs fehérje több komplexben is szerepelhet. Csak regulációs egységekről beszélhatünk: aktívátorokról represszorokról nem. Végső sorsuk csak a különálló egységekből szerveződő komplexekben dől el.

47 Ez a sors a: - regulációs DNS szekvenciától
- a sejtben éppen jelen levő regulációs fehérjéktől függ Koaktívátorok, korepresszorok: DNS maguk nem kötődő, de DNS kötő regulator fehérjékben részt vevő regulációs fehérjék. Különböző regulációs fehérje egyeülésekbe épülhetnek. A DNS szekvenca, melyhez kötődnek megváltoztathatja konformációjukat Általában rövidke DNS szakaszok vezérli szerveződésüket. Enhancoszóma: kiterjedtebb DNS-fehérje komplex Csak akkor fejeződik ki a gén, ha mindegyik fehérjealkotója jelen van a sejtben Magas fokú kombinációs kontroll lehetősége

48 Inzulátor elválasztó DNS szekvenciák
Mi biztosítja a szomszédos génátíródás befolyásolásának elkerülését? Legjobban ismert megoldás: inzulátor vagy határoló szekvenciák. DNS szakaszok, melyek specializálódott fehérjéket kötnek, két speciális tulajdonsággal rendelkeznek: - pufferelik a géneket a heterokromatin represszáló hatásától - képesek az enhancerek blokkolására Ehhez a promóter és az enhancer rész kzött kell lokalizálódniuk.

49 Az X kromoszóma inaktívációja
A kromatin szerkezet befolyásolja a génexpressziót Férfiak: XY Nők: XX X kromoszóma: nagy méretű több mint 1000 gén Y kromoszóma: kis méretű, kevesebb, mint 100 gén Kompenzációs mechanizmus Cél: kiegyenlíteni a férfiak és nők közti X kromoszóma géntermékek közötti mennyiségi különbséget Megvalósítás: a nők szomatikus sejtjeiben az egyik X kromoszóma transzkripciósan inaktíválódik

50 A nőnemű embrió sejtjeiben amikor még csak néhány ezer sejtből áll az egyik X kromoszóma jelentősen kondenzálódik, heterokromatin szerkezetet vesz fel. Ezt az erősen kondenzálódott szerkezetet nevezik: Barr testnek

51 Hogy melyik X kromoszóma inaktíválódik teljesen random dől el.
Ha már egyszer inaktíválódott, az a további osztódások során is úgy marad benne és utódaiban. Az inaktíválódás a pár ezer sejtből álló embrióban megy végbe Random Minden egyes nő különböző sejtek mozaikja

52 Ezek a mozaikos sejtek kisebb klasztereket alkotnak a felnőtt szervezetben, mivel a testvér sejtek egymás mellett maradnak a késöbbi fejlődés során. Ez okozza a macskák fekete-vörös teknőspáncél-szerű bundamintázatát. A hím macskák vagy teljesen feketék, vagy teljesen vörösek.

53 Hogyan következik be a transzkripciós inaktíválódás egy egész kromoszómán?
Az X kromoszóma inaktíválódása az X kromoszóma közepén egy helyről kiindulva indul és terjed tova mindkét irányba. XIC: X inaktívációs centrum, 106 bp, a heterokromatin kiindulási magja XIST: X inaktívációs specifikus transzkript; szokatlan RNS molekula az XIC-n belül kódolt, kizárólag az inaktívált X kromoszómáról expresszálódik, a sejtmagban marad nem iródik át fehérjére, elengedhetetlen az X kromoszóma inaktívációjához, ahogy a XIST RNS tovaterjed, úgy csendesedik el a gén.

54 X kromoszóma heterokromatin:
- XIST RNS - hiszton 2A - alacsony szinten acetilált H3, H4 - specifikus helyen metilált H3, DNS Megválaszolásra várnak: 1. Hogyan dől el, hogy melyik X kromoszóma inaktíválódik? 2. Milyen mechanizmus védi a másik X kromoszómát az inaktíválódástól? 3. Hogyan koordinálja az XIST RNS a heterokromatin szerveződését? 4. Hogyan marad inaktív a kromoszóma a sejtosztódások tömkelrgén keresztül?

55 DNS metiláció A DNS kovalensen módosítható, ami szintén lehetőséget nyújt a gén expresszió szabályozására. Gerincesekben a citozin metilálásának van fontos szerepe. A citozin metilálása nem befolyásolja a bázispárok kialakulását. N

56 Gerincesek DNS-ében a metiláció kizárólag a citozin nukleotidokat érinti, ott is a CG báziskettősben helyet foglalókat. XXXXXXCGXXXXXXX XXXXXXGCXXXXXXX CH3 CH3 fenntartó metiltranszferáz enzimek: a meglévő metilációs mintázat továbbörökítésének biztosítása

57 - passzív demetiláció (fenntartó metiltranszferázok szupressziója)
A DNS metilációs mintázat a gerincesek fejlődése alatt dinamikus változást mutat. Nem sokkal a megtermékenyítést követően demetilációs hullám söpör végig a teljes genomon. Demetiláció mechanizmusa: - passzív demetiláció (fenntartó metiltranszferázok szupressziója) - specifikus demetiláz enzimek Az új metilációs mintázat kialakításáért a de novo metiltranszferázok felelősek. A kialakult metilációs mintázat fenntartásáért a fenntartó metiltranszferázok felelősek. Bármelyik mutációja letális.

58 - adott szívetekben inaktívált gének
Gerincesekben a DNS metiláció elsősorban transzkripciósan inaktív régiókban található: - inaktív X kromoszóma - adott szívetekben inaktívált gének a gének inaktíválásában lehet szerepe Számos fehérje ismeri fel a metilált DNS-t: - kromatin remodellező komplexek - hiszton deacetiláló enzimek Végeredmény: kromatin kondenzáció A DNS metiláció önmagában nem elegendő a transzkripció inaktíválásához

59 Bizonyítékok 1. Plazmid DNS (aktin gén) metilált és nem metilált kópia izomsejt tenyészet metilációtól független aktin expresszió 2. Egy csendes gént bekapcsolva a metiláció csak jó néhány transzkripciót követően kerül le róla 3. Az X kromoszóma inaktívációja még jóval detektálható metilációja előtt bekövetkezik A már kikapcsolt gén represszióját mintegy csak megerősíti.

60 Két különböző típusú gerinces sejtben egy adott gén expressziója 106-szoros különbséget mutathat.
Baktériumban egy expresszált és egy nem expresszált gén transzkripciója között mindössze 1000-es különbség lehet. Gerincesekben a DNS metiláció is hozzájárulhat (a kromatinban bekövetkező változásokon keresztül) ehhez a nagy különbséghez. A több ezer lötyögős gén expressziója is hozzájárulhat ahhoz, hogy a fenntartó DNS metiltranszferáz mutáns egér embriók életképtelenek.

61 DNS metiláció a genomi mintázatban
emlős sejtek diploidok: apai, anyai génszettek Egyes esetekben a gén expressziója attól függ, hogy az apától, vagy az anyától származnak: genomi mintázat/lenyomat. Példa: Igf2 gén (inzulin-szerű növekedési faktor) Terméke a prenatális fejlődéshez szükséges, hiányában a normális születési súly felével születik. Csak az apai Igf2 kerül transzkripcióra. apai Igf2 mutálódik satnya egerek hibás anyai Igf2 normális egerek

62 emlékeznek eredetükre
Az ivarsejtek kialakulása alatt a lenyomatololásnak kitett gének annak függvényében metilálódnak, hogy a spermiumban, vagy a petesejtben találhatóak-e. A lenyomat géneket nem érinti a megtermékenyítést követő demetilációs hullám emlékeznek eredetükre ennek megfelelően szabályozódnak

63 Az esetek többségében a metilálciós lenyomat a gének csendességét okozza, néhány esetnben a gén kifejeződésének aktiválását okozza. Példa: Igf2 apai eredetű inzulátor szakasz metilált transzkripció anyai eredetű nincs inzulátor metilálás transzkripció X

64 CG szigetek Nem metilált citozin dezaminálása uracilt eredményez normálisan nincs jelen a DNS-ben kivágás, citozin pótlás metilált citozin dezaminálása timint eredményez normálisan is jelen van a DNS-ben sokszor nem kerül felismerésre, korrigálásra a hiba Az evolúció során a metilált citozin részletek jelentős része timinné alakult. A megmaradt CG párosok egyenlőtlenül oszlanak el a genomban. A genom bp -os részleteiben szor gyakrabban találhatók, mint átlagosan: CG szigetek

65 Ezek általában nem metilált citozin részleteket tartalmaznak.
Gyakran helyezkednek el house keeping gének promóterei körül house keeping gének:kiemelt fontossággal bírnak a sejt életképességét tekintve, ezért majd minden sejt kifejezi őket. szövet specifikus gének: csak az adott sejttípusban fejeződnek ki

66 A CG metilációval a DNS inaktíválása a cél.
Gerincesekben metil C T mutáció csak akkor örökíthető tovább, ha még az ivari vonalon bekövetkezik. Az ivarsejtekben a legtöbb gén metilált inaktív Az evolúció során dezaminálódnak, elvesznek. Az aktív állapotban tartott gének (a fontos house keeping gének is) aktívak, tehát nem metiláltak Mutáció bekövetkeztekor ezek egyből felismerésre, javításra kerülnek

67 A szekvencia specifikus DNS-kötő fehérjék meghatározása: gél mobility shift assay

68 A szekvencia specifikus DNS-kötő fehérjék tisztítása: DNS affinitás kromatográfia

69 A gén regulációs fehérjék felismerte DNS szakasz meghatározása

70 A gén-regulációs fehérjék elfoglalta DNS szakaszok meghatározása kromatin immunoprcipitációval