Szövet-szelet tenyészetek

Az előadások a következő témára: "Szövet-szelet tenyészetek"— Előadás másolata:

1 Szövet-szelet tenyészetek
mm vastag szeletek; Tápanyag-ellátás, átáramoltatás, gáz-ellátás Gähwiler et al., TINS 1997 Medium szelet-preparáláshoz (1 óra, 4OC, frissen készítendő) 1. Gey’s Balanced Salt Solution 100ml % 2. Glucose 45% 1.1ml mg/m Szövet-szelet tenyésztő médium (eltartható 1-2 hétig 37 OC, 5% CO2 mellett; +4 oC-on 2-3 hétig) 1. Eagle Basal Medium Hanks 50ml % 2. Hanks’ Balanced Salt Solution 25m % 3. Horse Serum (heat inactivated) 25ml % 4. Glucose 45% 1.1ml mg/ml 5. L-glutamine 0.2M 500l mM 6. Penicilline-streptomycin mixture 500l l/ml-25l/ml

2 Megvásárolható „primér” sejttenyészetek: korlátozott számú passzázs;
Nem „halhatalan”, ún. primér szöveti sejtek : korlátozott ideig passzálhatók Valódi szöveti sajátságokat jobban őrzik, mint a halhatatlan sejtvonalak Megvásárolható „primér” sejttenyészetek: korlátozott számú passzázs; Sejttípusra jellemző sajátságok állandó ellenőrzése szükséges! fibroblaszt neural stem „Halhatalan” sejtvonalak stabilabbak, de szöveti sajátságokat kevésbé őrzik Elsősorban általános sejtbiológiai kérdések vizsgálatára, gének kifejezésére, speciális sajátságú sejtek előállítására használhatók

3 Sejt-vonalak Végtelenségig osztódó, in vitro fenntartott, szövet-eredetű sejtek; „halhatatlan” sejtpopulációk Normál szöveti sejtek nem halhatatlanok; telomer-rövidülés (Hayflick L Exp. Cell Res) DNS-javítás hibái „Ős”- stem (törzs)-sejtek : önmegújítás képessége végtelen? ES; (Evans,Kaufman Nature ; Thomson et al., Science ) EC; (Martin, Evans 1974 Cell) Tumorosan transzformált sejtek : folytonos osztódásra képesek lehetnek HeLa, stb Génbevitellel immortalizált sejtek sejtciklust stimuláló virális gének (AV E1; SvTag; v-Myc), pl. HEK293, COS, stb sejtciklust szabályozó gének kiütése (p53, RBp stb kiütése) „őssejt-gének” (SOX2, c-Myc, Kfl-4, Oct4) bevitele : indukált pluripotens őssejtek (iPSC) Tumoros sejtekkel való sejtfúzió hibridóma vonalak (ellenanyag-termelő és myeloma B sejtek fúziója)

4 Sejtvonalak és sejt-klónok
Sejtvonal : sokszoros passzázs után fenotípusosan azonos sejtek Sejt-klón : egyetlen sejtből származó populáció; pheno- és genotípusát tekintve is azonos sejtek 2. ½ x Klónozó gyűrűvel való izolálás 1. Klónozás primér tenyészetből, sejtszuszpenzióból ½ x Sorozatos higítás

5 Sejt-klónok fenntartása
geno-, fenotípus megtartása folytonos osztódások alatt Változás okai: Sejt-kölcsönhatások→ fenotipikus változások környezeti hatások → feno- és genotípus változások (!) „Túlnövés” → gyorsan növekvő, sűrű körülmények között életképes sejt-változat szelektálódik Gén-szintű változások : valószínűség ~ 10-8 GFP-4C Ellenőrzés: Kromoszómaszám meghatározás Növekedési ráta Fenotípus jellegzetességei Recultured GFP-4C MTT

6 Sejt-fagyasztás Sejt-felvétel
Kristályképződés: fagyásvédő additívumok fokozatos lehűtés Tárolás : folyékony N2 ! Sejt-felvétel Átkritályosodás : gyors felolvasztás Fagyásvédő anyagok gyors eltávolítása Sejttípustól függő protokoll!!!

7 General Cell Collection Hybridoma Collection Primary Cells HLA-Typed Collection Human Random Control Collection Human Genetic Collection DNA Products General Cell Collection: C1300 CLONE NA Catalogue No.: Cell Line Name:C1300 CLONE NA Keywords:Mouse neuroblastoma Cell Line Description: CLONE NA is a subclone of Neuro-2a, a clonal line of C1300 mouse neuroblastoma cells. The cells were selected for spontaneous mutations deficient in HGPRT in the presence of 8-azaguanine. This cell line has been mycoplasma eradicated at ECACC. Species:Mouse Tissue:Neural Morphology:Neuronal-like Growth Mode:Adherent Subculture Routine:Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 2-4x10,000 cells/cm² using 0.25% trypsin/EDTA; 5% CO2; 37°C. Cultures may not form a complete monolayer before subculture is required. Culture Medium:RPMI mM Glutamine + 10% Foetal Bovine Serum (FBS).

8 ATCC® Number: CRL-2925™    Price: £378.00; €518.00 Designations: NE-4C Depositors:  E Madarasz Biosafety Level:1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties:adherent Organism:Mus musculus (mouse) Morphology:neuroepithelial Source:Organ: brain Tissue: neuroectodermal Cell type: neural stem cell Strain: C57Bl/Sv129 Permits/Forms:In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location. Antigen Expression:Sox-2, Otx-2, En-1 Cell line:PK-15Cell type:pig kidney DSMZ no.:ACC 640 Origin:derived by single-cell cloning of the parent cell line PK-2a in 1957, which was established in 1955 from the kidney of an adult pig; cells were shown to carry an endogenous C-type retrovirus and to be susceptible to various viruses, e.g. viruses causing Hog cholera, African swine fever, and foot and mouth disease References:Pirtle and Woods, , Am. J. Vet. Res. 29: (1968), PubMed ID Armstrong et al., , J. Gen. Virol. 10: (1971), PubMed ID Todaro et al., , Virology 58: (1974), PubMed ID Depositor:Dr. C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig, Germany

9 Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása)
Tranziens ↔ Permanens transzfekció

10 Mesterséges kromoszómák : 300,000(BAC) to 1,000,000(YAC)
Mit viszünk be? I. Vektorok Plasmidok: kettős szálú DNS; ~ bp; ha önálló replikációra képes → permanens transzfekció Mesterséges kromoszómák : 300,000(BAC) to 1,000,000(YAC)

11 Mit viszünk be? Viralis vektorok promóter1 kívánt „open frame”
Lonza promóter1 kívánt „open frame” promóter2 eukaryota rezisztencia gén promóter3 bakteriális origo promóter4 bakteriális rezisztencia gén „multi-cloning” hely (MCS) Bakteriális expresszió

12 Mobilis szakaszok: transzpozon-transzpozáz rendszerek
Transzpozon: „ugráló gén”; Transzpozáz: szekvencia-specifikusan hasítja a transzpozon-végeket és illeszti be szekvencia-specifikus helyekre PiggyBac; Sleeping Beauty Replicative transposition. Cut-and-paste transposition

13 X Feltételes gén-expressziós modellek I.
Doxicyclin-gátolható konstrukció Doxicyclin-aktiválható konstrukció Feltételesen immortalizált idegi sejtvonalak kettősen transzgenikus egerekből ATG Neurofilamentum-L promoter LAP 348 gén SV40 Tag gén LAP 348 IPTG Lac-érzékeny „operátorok” Transzgenikus egerek Kettősen transzgenikus egerek: NF-promóterről feltételesen vezérelhető Tag X LAP-egér Tag-egér Baim SB et al., PNAS 88:

14 Feltételes gén-expressziós modellek II.
Cre – Lox rendszer : Cre DNS-rekombináz (P1 bakteriofág hely-specifikus rekombináz enzime) meghatározott DNS-szekvenciához – a pallindrom-core-pallindrom szerkezetű, 34 bp - LoxP hely „core” régiójához kötődik, és a pallindrom szakaszt vágja ki, rekombinálja vagy fordítja meg. LoxP LoxP A Cre-enzim expressziójának időzítésével, a Lox-tartalmú gének a kívánt időszakban kivághatók, vagy aktiválhatók Andras Nagy, Genesis

15 DNS bejuttatása a sejtmembránon át
Ca-foszfát, lipidamin-anyag, liposzóma dendromerek, poli-kationons polimerek (PEI, PAMAM, stb) Replkációra képtelen hordozó Virus (pl, lenti, adeno, stb) mikro-injekció elektroporáció „génpuska” Módszer kiválasztása sejttípustól, konstrukciótól is függ 2M Ca-foszfát Nagy-szemcséjű DNS-CA2+ csapadék; internalizált szemcsék 2-12 óra múlva; Tápcsere!!! Transzfekciós gyakoriság ellenőrzése óra múlva Szérum-mentes és szérumos közegben is működik; Jelentős sejtpusztulás!

16 Elektroporáció Gén-belövés „gén-puska”
Elv: sejtmembrán pont-szerű elektromos sértése Gén-belövés „gén-puska” nanotechnológia

17 Lipid-DNS micellák; DNS tartalmú liposzómák
Elv: lipid-anyag beolvadása a sejt-membránba 5 mm Nem-szelektált GUV lecithin liposzóma” Lipofectamin, Transfectin, Lipofectin Poli-amin dendromerek (PEI, PAMAM, stb) Tang, M.X., et al.,. Bioconjugate Chem. 7, 703. Quiagen SuperFect : a dendromer model for DNA binding polyamido-amine dendromer DNA – dendromer interaction Elv: endocytosis DNS-komplexálás ?

18 Replkációra képtelen hordozó virussal (pl, lenti, adeno, stb) való bejuttatás
„termelő” sejt: vírusburok képződik, virális replikáció génjei nem Normál tápban; néhány óra; nagy transzfekciós gyakoriság; DE..... Fizikai módszerek Direkt injektálás; hólyagcsíra ES sejtek

19 Tranziens versus permanens transzfekció
Citoplazmában (időleges) mRNS átírás ~ % Bevitt DNS beépül a sejtek genomjába; sejtosztódással „szaporodik” ~ 2-5 % Transzfekciós hatékonyság: Gént hordozó sejtek az összes sejt %-ában Transzfektált sejtek kiválogatása Permanens transzfekció esetén, a gén-hordozó sejtek száma nő az idővel, de az aránya nem feltétlenül (!); Jelző-gének egyidejű bevitele biztosítja a kiválogathatóságot. Fluoreszcencia alapján : GFP, YFP, mCherry, stb fluoreszcens fehérjét kódoló jelzőgén; FACS válogatás Antibiotikum-rezisztencia alapján: adott antibiotikumot (neomicint, zeocint, stb) bontó enzimet kódol a „jelző”gén; megfelelő koncentrációjú antibiotikum jelenlétében való sejtnövesztés Anyagcsere-enzim működése alapján: a jelző gén olyan enzimet kódol, amellyel a sejt olyan táp-környezetben is nő, amiben a nem-transzfektált sejtek elpusztulnak (pl. hypoxanthine-aminopterin-thymidine; HAT szelekciós médium) Válogatás leggyakrabban:

20 Sejt-szervecske specifikus fluoreszcens fehérjék transzfektálása
Human aortic smooth muscle cell (HASMC) labeled with CellLight Lysosomes-RFP (C10597) and CellLight MAP4-GFP (C10598) reagents and with Hoechst nucleic acid stain Live cell imaging with CellLight™ reagents in neurons. Cultured hippocampal neurons were transduced with CellLight™ Synaptophysin-RFP (Cat. No. C10610). Imaging was performed on live cells using a DeltaVision® Core microscope and standard TRITC filter sets. MolecularProbes

21 HAT – medium Fuzionált hybridoma sejtek válogatása
Hypoxantin-aminopterin-timidin Fuzionált hybridoma sejtek válogatása