Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása) www.protocol-online.org Tranziens ↔ Permanens transzfekció

Mesterséges kromoszómák : 300,000(BAC) to 1,000,000(YAC) Mit viszünk be? I. Vektorok Plasmidok: kettős szálú DNS; ~ 10 000 bp; ha önálló replikációra képes → permanens transzfekció Mesterséges kromoszómák : 300,000(BAC) to 1,000,000(YAC)

Mit viszünk be? Viralis vektorok promóter1 kívánt „open frame” Lonza promóter1 kívánt „open frame” promóter2 eukaryota rezisztencia gén promóter3 bakteriális origo promóter4 bakteriális rezisztencia gén „multi-cloning” hely (MCS) Bakteriális expresszió

Mobilis szakaszok: transzpozon-transzpozáz rendszerek Transzpozon: „ugráló gén”; Transzpozáz: szekvencia-specifikusan hasítja a transzpozon-végeket és illeszti be szekvencia-specifikus helyekre PiggyBac; Sleeping Beauty Replicative transposition. Cut-and-paste transposition

X Feltételes gén-expressziós modellek I. Doxicyclin-gátolható konstrukció Doxicyclin-aktiválható konstrukció Feltételesen immortalizált idegi sejtvonalak kettősen transzgenikus egerekből ATG Neurofilamentum-L promoter LAP 348 gén SV40 Tag gén LAP 348 IPTG Lac-érzékeny „operátorok” Transzgenikus egerek Kettősen transzgenikus egerek: NF-promóterről feltételesen vezérelhető Tag X LAP-egér Tag-egér Baim SB et al., 1991. PNAS 88: 5072-5076

Feltételes gén-expressziós modellek II. Cre – Lox rendszer : Cre DNS-rekombináz (P1 bakteriofág hely-specifikus rekombináz enzime) meghatározott DNS-szekvenciához – a pallindrom-core-pallindrom szerkezetű, 34 bp - LoxP hely „core” régiójához kötődik, és a pallindrom szakaszt vágja ki, rekombinálja vagy fordítja meg. A Cre-enzim expressziójának időzítésével, a Lox-tartalmú gének a kívánt időszakban kivághatók, vagy aktiválhatók Andras Nagy, 2000. Genesis

Módszer kiválasztása sejttípustól, konstrukciótól is függ DNS bejuttatása a sejtmembránon át Ca-foszfát, lipidamin-anyag, liposzóma dendromerek, poli-kationons polimerek (PEI, PAMAM, stb) Replkációra képtelen hordozó Virus (pl, lenti, adeno, stb) mikro-injekció elektroporáció „génpuska” Módszer kiválasztása sejttípustól, konstrukciótól is függ 2M Ca-foszfát http://www.flemingtonlab.com/Protocols/CalciumPhosphateTransf.pdf Nagy-szemcséjű DNS-CA2+ csapadék; internalizált szemcsék 2-12 óra múlva; Tápcsere!!! Transzfekciós gyakoriság ellenőrzése 24-48 óra múlva Szérum-mentes és szérumos közegben is működik; Jelentős sejtpusztulás!

Elektroporáció Gén-belövés „gén-puska” Elv: sejtmembrán pont-szerű elektromos sértése Gén-belövés „gén-puska” nanotechnológia

Lipid-DNS micellák; DNS tartalmú liposzómák Elv: lipid-anyag beolvadása a sejt-membránba 5 mm Nem-szelektált GUV lecithin liposzóma” Lipofectamin, Transfectin, Lipofectin Poli-amin dendromerek (PEI, PAMAM, stb) Tang, M.X., et al.,. Bioconjugate Chem. 7, 703. Quiagen SuperFect : a dendromer model for DNA binding polyamido-amine dendromer DNA – dendromer interaction Elv: endocytosis DNS-komplexálás ?

Replkációra képtelen hordozó virussal (pl, lenti, adeno, stb) való bejuttatás „termelő” sejt: vírusburok képződik, virális replikáció génjei nem Normál tápban; néhány óra; nagy transzfekciós gyakoriság; DE..... Fizikai módszerek Direkt injektálás; hólyagcsíra ES sejtek

Tranziens versus permanens transzfekció Citoplazmában (időleges) mRNS átírás ~ 10-30% Bevitt DNS beépül a sejtek genomjába; sejtosztódással „szaporodik” ~ 2-5 % Transzfekciós hatékonyság: Gént hordozó sejtek az összes sejt %-ában Transzfektált sejtek kiválogatása Permanens transzfekció esetén, a gén-hordozó sejtek száma nő az idővel, de az aránya nem feltétlenül (!); Jelző-gének egyidejű bevitele biztosítja a kiválogathatóságot. Fluoreszcencia alapján : GFP, YFP, mCherry, stb fluoreszcens fehérjét kódoló jelzőgén; FACS válogatás Antibiotikum-rezisztencia alapján: adott antibiotikumot (neomicint, zeocint, stb) bontó enzimet kódol a „jelző”gén; megfelelő koncentrációjú antibiotikum jelenlétében való sejtnövesztés Anyagcsere-enzim működése alapján: a jelző gén olyan enzimet kódol, amellyel a sejt olyan táp-környezetben is nő, amiben a nem-transzfektált sejtek elpusztulnak (pl. hypoxanthine-aminopterin-thymidine; HAT szelekciós médium) Válogatás leggyakrabban:

HAT – medium Fuzionált hybridoma sejtek válagatása Hypoxantin-aminopterin-timidin Fuzionált hybridoma sejtek válagatása http://www.dls.ym.edu.tw/imm/Applications%20of%20Ab%20Molecules-041306.pdf