MSc 2012 ENZIMES ÖSSZEFOGLALÓ Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1  mol szubsztrátot alakít át vagy 1  mol terméket képez 1 perc alatt adott reakció körülmények között. E + S P + E mol/dm 3 !!!! E/tf E/mg fajlagos aktivitás MIÉRT NEM MÉRHETŐ? Michaelis és Menten SI rendszerben: 1 Katal: 1 mol szubsztrátot alakít át 1 s alatt. hatalmas enzim mennyiség nKat = Kat 1 Kat = 6*10 7 U, 1U =1.6*10 -8 Kat, 1U= 1/60  Kat

Michaelis-Menten kinetika E + S ES E + P k 1 k k 2 k -2 feltételezések: *k -2 =0 *első lépés gyorsan egyensúlyra jut= RAPID EKVILIBRIUM *stabil ES komplex, EP komplex elhanyagolható *egy aktiv centrum, egy szubsztrát aktivitás helyett cc használható S   E 0 vagyis E 0 / S < <1 k 1 SE = k -1 (ES) az (ES) disszociációs állandója a „minket érdeklő” reakciósebesség: anyagmérleg osszuk el ezt a kettőt egymással

Michaelis-Menten kinetika Rendezzük át!

BRIGGS-HALDANE KINETIKA S   Eo d(ES)/dt =0 steady state NAGYON RÖVID IDŐ HOSSZÚ IDŐ

PRE-STEADY STATE

BRIGGS-HALDANE KINETIKA K m =(k -1 + k 2 ) / k 1 Michaelis állandó

DISZKUSSZIÓ Michaelis -MentenBriggs-Haldane ha num(k 1 )> >num(k 2 ) a két konst. azonos!

V=(V max /K S )*S 1.rendû tartomány 0. rendű tartomány V max = k 2 E O V S K m ; K S DISZKUSSZIÓ S  Ks Ha S  Ks derékszögű hiperbola látszólagos elsőrendű sebességi állandó katalitikus effektivitás= specfi(ci)tás állandó K m /V max = specfi(ci)tás idő

L-B, L-H, E-H ábrázolások 1/S -1/K m tg  =K m /V max 1/V  V max tg  =1/V max S/V S K m /V max KmKm V V/S V max tg  =-K m V max /K m

V 0 értelmezése V 0 = ( dS/dt ) t=0 S t P t V 0 = ( dP/dt ) t=0 A M-M és B-H egyenletekben V kezdeti reakciósebességet jelent!!!

A k 2 meghatározása és V max E 0 -függése V max3 =k 2 E O3 V max2 =k 2 E O2 V max1 =k 2 E O1 KmKm E O1 E O2 E O3 EOEO S V tg  = k 2

A kinetikai paraméterek értelmezése 1 V max IUBMB:nem max, hanem limit!!! HATÁRSEBESSÉG k cat : [ s -1 ] Egy enzimmolekula átalakítási frekvenciája S-telítés esetén NEM ENZIMTULAJDONSÁG V max = k 2. E 0 = AKTIVITÁS k 2 [s -1 ] ENZIMTULAJDONSÁG = turnover number, váltásszám V max = k cat. E 0 Kiterjesztés minden enzimre és minden kinetikára K m, K S -Közelítőleg az S az élő sejtben - az enzim affinitása - A = B ??? -Változott a K S Inhibitor?Aktivátor? -Enzimanalitika S>>KS Túl érzékeny érzéketlen

A kinetikai paraméterek értelmezése 2 k dm 3 mol -1 min -1  max. érték(10 11 ) kis molekulák diffúzió-sebessége  k min -1 k min -1 K m mol/dm 3 katalitikus effektivitás= specfi(ci)tás állandó Legtöbb enzim e két szélső eset között

k cat alsó határa metabolikus enzimeknél Természetes enzimeknél: >10 5 Mesterséges e-nél (DNA-zyme, abzyme:<10 3 < M -1 s -1 diffúziókontrollált bimolekuláris reakció

ENZIM MODULÁCIÓ

INHIBÍCIÓ REVERZIBILIS IRREVERZIBILIS E + S ES E + P + I E I DINAMIKUS EI KOMPLEX LINEÁRIS INHIBÍCIÓ komplett k P NEMLINEÁRIS INHIBÍCIÓ (HIPERBOLIKUS) részleges βk P „csökkent, maradék aktivitás” 1/V - I ábrázolás DIXON ábrázolás

KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ VERSENGÉS S ÉS I KÖZÖTT AZ E AKTÍV HELYÉÉRT, VAGY..... KÖLCSÖNÖS KIZÁRÁS I szubsztrát analóg alternatív szubsztrát termék MODELLEK 1.MODELL: Klasszikus kompetitív inhibíció Az I verseng S-sel ugyanazon aktív hely elfoglalásáért 2.-3 MODELL: sztérikus GÁTLÁS 4. MODELL: átlapoló helyek esete :1 és 3 kötő hely képes az i, a 2 és 4 kötő hely pedig az S megkötésére, de egymást kölcsönösen kizárják 5. MODELL: I kötõdése az enzimhez konformáció változást okoz az enzimen és ez megakadályozza S-nek az aktív centrumhoz kötődését. Ilyen a végtermék gátlás (feed back inhibíció) is.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 5.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 6.

kompetitiv inhibició k. termék inhibició alternativ v. versengő szubsztrátok ANALÓGIÁK

NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ KSKS KSKS KIKI KIKI

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ Az inhibitor a látszólagos V max értéket változtatja meg, K s (illetve K m ) értékét nem befolyásolja.

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 1 Ks kp E + S ES KsKs kpkp E + P + I ESI I csak az ES-hez kötődik I kötő hely „nem kész” I kötő hely „ kész” S kötő hely eltorzult

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 2 mi változott? l.nemkomp.inh. a komp forditottja, K S csökken Egy unkompetitiv I K S és V max értékét ugyanolyan mértékben csökkenti

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ I JELENLÉTE MÓDOSITJA S -NEK ES -RŐL TÖRTÉNŐ DISSZOCIÁCIÓJÁT l. nemkomp!!! DE E + S ES E + P + I EI + S ESI K S  K S K I  K I k P ahol K S =E.S/ES,  K S =EI.S/ESI K I =E.I/EI  K I =ES.I/ESI E ES ESI E EI ESI

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 2 L. NEMKOMP!!! nemkomp unkomp komp

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 3

INHIBICIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA S és I kölcsönösen kizárják egymást az enzimről KOMPETITIV S és I egymástól függetlenül kötődnek az enzimre NEMKOMPETITIV mint előző, de az I megváltoztatja az enzim affinitását KEVERT TIPUSÚ I csak a S után kötődik UNKOMPETITIV

SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ -- A szubsztrátnak ahhoz, hogy termékképző átmeneti komplex jöjjön létre, két vagy több helyen kell, hogy az enzimhez kötődjék. Sok S molekula → egy S molekula az egyik, másik S molekula pedig egy másik kötőhelyhez kapcsolódik s így inaktív komplexek jönnek létre (ez is reverzibilis inhibíció). E - OOC CH 2 - OOC E CH - OOC Succinate Malonate E - OOCCH 2 CH 2 COO - Normal S inhibition

■-- Nagy S koncentrációnál egy S molekula olyan kötőhelyhez is kapcsolódhat az enzimen, amely nem az aktív centrum része, az ilyen kötődés mintegy NEMKOMPETITIV (v. unkompetitiv) módon megakadályozza a normális S kötődést. ■--Az enzim működéshez szükség lehet egy aktivátor molekulára. Ha ez kapcsolódni képes a szubsztráttal, sok S molekula "elvonja" az enzimtől az aktivátort, így csökkentve annak tényleges aktivitását. ■--Két (vagy több) szubsztrátos reakciók esetén az egyik szubsztrát feleslege lekötheti a másik szubsztrát kötő helyeit, megakadályozva a szükséges második szubsztrát kapcsolódását, így megintcsak inaktív komplexek jönnek létre. ■-- Nagy S koncentráció aspecifikus módon is gátolhatja a reakciót, például az ionerősség megnövekedése miatt. SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ

V V max =0.9,Ks=50,K i =10 V max =0.9,Ks=50,K i =50 V max =0.9,Ks=50,K i =100 Szubsztrát koncentráció (mg/L)

A.)Termékképzéshez egyszerre több különbözõ szubsztrát kell, hexokináz glükóz + (Mg)ATP Glükóz-6-foszfát + (Mg)ADP foszforilezés két termék B.) A másik esetben a reakció keverékben egy enzim és több különböző, lényegében alternatív szubsztrát. példák: a legtöbb biopolimer hidrolizáló enzim amiláz, amilo-glikozidázok, cellulázok proteinázok. Függetlenül attól, hogy ezekben az esetekben exo- vagy endo-enzimekről van-e szó, a reakció-keverékben egyidejűleg több, különböző polimerizációs fokú szubsztrát van (lesz) jelen. TÖBB SZUBSZTRÁTOS REAKCIÓK MSc 2009 Két tipus

EGYÉB HATÁSOK AZ ENZIMAKTIVITÁSRA Ionerősség pH Hőmérséklet Nyírás Nyomás (hidrosztatikai) Felületi feszültség Kémiai szerek (alkohol, urea, H 2 O 2...) Fény, hang, ionizáló sugárzások REVERZIBILIS VÁLTOZÁSOK IRREVERZIBILIS

Y i pH 1 Y Y - Y 2- Y= Y 2- = pH hatása 2 !

Hőmérséklet hatása Kettős hatás Reakciósebesség nő Csökken: denaturálódás irreverzibilis reverzibilis E a E i KdKd Mivel E 0 = E a + E i  = kombináció (β,k B,h,E 0,  S*) K m is függ T-től!

Hőmérséklet hatása Időtől is függ! β 

REVERZIBILIS REAKCIÓK 1 Sok enzim katalizálta reakció - főként a biopolimer hidrolízisek - nagymértékben a jobboldali irányba eltolt egyensúllyal rendelkeznek, → gyakorlatilag k -2 valóban elhanyagolható. De például a glükóz fruktóz (glükóz izomeráz)gyakorlatban is egyensúlyi reakcióként viselkedik E + S ES E + P k1k1 k -1 k2k2 k -2 1/K S KPKP

REVERZIBILIS REAKCIÓK 2 Végezzük el a következő osztásokat: HALDANE összefüggés

REVERZIBILIS REAKCIÓK 3 E MI TÖRTÉNIK? S → P vagy P → S ? S P MITŐL FÜGG? K eq, S, P értéke

V netto = V előre - V vissza = k 2 (ES) - k -2 (EP) Ahol: MCA