Ungvári Ildikó – SE, GSII Allergiás asztma genomikai háttere 2007. november 14. Ungvári Ildikó – SE, GSII

Asztma (Asthma bronchiale) krónikus légúti betegség. Jellemző a kis légutak epizódokban jelentkező gyulladása és szűkülete különböző triggerelő tényezőkre. Az asztma rohamok lehetnek enyhék és életveszélyesen súlyosak. Tünetei:légszomj, köhögés, zihálás, mellkasi fájdalom, és feszülés, valamint ezek kombinációi. A kiváltó okok lehetnek: allergének, fertőzés (vírus/ baktérium), fizikai munka, hirtelen éghajlatváltozás, légszennyezések mint pl. cigarettafüst + hajlamosító genetikai háttér típusai: - allergiás asztma (extrinsic asztma) : immunológiai mechanizmusok által mediált, - nem-allergiás asztma (intrinsic asztma) Két fázis: korai tünetek: 15-30 perccel, késői: 4-6 órával a provokáció (pl. antigén belélegzés) után.

Az allergiás megbetegedések új definíciói I Az allergiás megbetegedések új definíciói I. (EAACI javaslat 2001 szeptember) Az allergia immunológiai mechanizmus által indított túlérzékenységi reakció. Az allergián belül megkülönböztethetünk IgE által, és nem-IgE által mediált allergiát. Az atópia az egyéni, vagy családi hajlam arra, hogy az egyén alacsony dózisú allergén, általában fehérjék hatására IgE ellenanyagot termeljen és olyan jellegzetes tüneteket mutasson mint az asztma, rhinoconjunctivitis, vagy az ekcéma/dermatitis.

> 150 millió asztmás van a világon, a leggyakoribb krónikus betegség gyermekkorban. USA: 11 milliárd $/év

Asztma gyakorisága néhány országban egy 2002-2003-as felmérés alapján 6-7 és 13-14 évesek UK 20.9% 24.7% Germany 12.8% 17.5% Austria 7.4% 15.1% USA - 22.3% Japan 18.2% 13.0% New Zealand 22.2% 26.7% Indonesia 2.8% 5.2%

Az allergiás betegségek heterogenitása Az allergiás asztmás betegeknek 60-80%-nak szintén van allergiás rhinitise. Az allergiás rhinitises betegek 20-38%-ának van asztmája. Becslések szerint az AEDS-es (atópiás ekcéma/dermatitis szindróma) újszülöttek 40%-nál 3-4 éves korára asztma fog kialakulni. Más tanulmányokban az asztmás betegek 35%-nak van AEDS-e. Genomikai vizsgálatokban az asztmás csoportban általában ugyanúgy kezelik azokat a betegeket, akiknek asztmája és allergiás rhinitise van, mint az asztmás és AEDS-es betegeket. Feltéve, hogy vannak olyan gének, amelyek az alsó légutak gyulladásáért felelősek (asztma), vannak olyanok, amelyek a felsőért (rhinitis), vagy általában az atópiás hajlamért, vagy az ekcémáért, ezek a gének könnyen elveszhetnek ezekben a vizsgálatokban.

Néhány immunológiai alapfogalom Antigén:Az érett immunrendszer által felismert (sokszor fehérjeeredetű) struktúrák. Antitest: B sejtek termelik, pl.: IgG,IgA, IgM, IgE Néhány immunsejt: Antigén bemutató (prezentáló) sejtek (APC): pl.: B sejt, monocita/makrofág, dendritikus sejtek: bekebeleznek (internalizálnak) különböző struktúrákat (pl: mikróbák, virágpor stb.), majd egy darabkájukat (az antigént) a felszínűkre viszik MHCII molekulákhoz kapcsoltan. B sejt makrofág

T sejtek: felületükön levő receptorukkal (TCR) hozzákötődnek az antigén-MHCII komplexhez és néhány mellette levő molekulához (kostimulációs molekulák) és aktiválódnak, különböző anyagokat bocsájtanak ki a környezetükbe. Asztmában fontos: CD4+ T helper sejtek (Th). Th0 sejtek citokinek hatására differenciálódhatnak Th1, vagy Th2 irányba

Th2 sejt-B sejt kölcsönhatás

Th0 sejt Th1 Th2

Az asztma gyakoriságának emelkedése A XX. század elején Budapesten évente egy-két új asztmás gyereket diagnosztizáltak, 2002-ben 17.912-t.

Miért emelkednek az allergiás betegségek prevalencái? Legelfogadottabb a tisztasághipotézis (Th1 trigger hipotézis) : a nyugati típusú társadalmakban nem engedjük, hogy a Th1 felé eltolódott immunválasz kialakuljon. Th1 érés (maturation) hipotézis: A Th1 érés defektussal született gyerekek régebben meghaltak, manapság a jobb egészségügyi ellátás miatt életben maradnak, de allergiások, asztmásak lesznek.

Miért emelkednek az allergiás betegségek prevalencái? (II) Antibiotikumok használata A levegőben levő szennyeződések reagálnak az allergénekkel és agresszívabbá teszik őket.

Az asztmára való hajlam fő oka, hogy a Th1/Th2 egyensúly eltolódik Th2 irányba

Elhunyt asztmás tinédzser tüdőszövettani vizsgálata Elhunyt asztmás tinédzser tüdőszövettani vizsgálata. Fő jellemzők: I = gyulladás (gyulladási sejtek beáramlása), MP = mucus plugging: légutakat a nyák eldugaszolja, Légúti remodelling: SF= subepitéliális fibrózis: kollagén lerakódás, MH= miociták hipertrófiája és hiperpláziája: a simaizmok térfogatának és számának növekedése, N= neovascularisatio: új erek képződése; ezek irreverzibilis változások

Légúti hiperreaktivitás (AHR= airway hyperresponsiveness, BHR = bronchial ...): az asztma egyik jellemzője. Túlérzékenység különböző stimulusokra, mint például: allergének, légszennyeződések, hideg levegő, fizikai munka, metakolin, hisztamin stb. A kiváltó ok megszüntetésével, vagy glükokortikoid hatására a fulladás megszűnik. Légúti hiperreaktivitás mértéke különböző súlyosságú asztmás betegekben (metakolin (Mch) hatására spirométerrel) FEV1: forced expiratory volume 1s

Egér asztma modell előnyei Humán asztmához hasonló jellemzők Ag-spec IgE Hízósejtek, T-limfociták, eozinofilek infiltrációja a tüdőbe Th2 citokin mintázat Légúti túlérzékenység nem-specifikus bronchokonstriktorokra (MCh) Szövetek hisztopatológiai vizsgálatának lehetősége Genetikailag módosított egerek: KO, TG Egér specifikus ellenanyagok és reagensek Terápiás eszközök kipróbálásának lehetősége

Egér asztma modell hátrányai Nem krónikus Eozinofilek nem degranulálódnak Az egerek nem köhögnek A különböző egértörzsek máshogy reagálnak

Egér asztma modell Provokáció Szenzitizálás I Szenzitizálás II 29 0 14 28 30 32 I.p. OVA (hasba) I.p. OVA OVA inhaláció + Al(OH)3 + Al(OH)3 1 % 5 % Tüdő-szövettani vizsgálat BAL (bronchoalveoláris lavage ) sejtösszetétel vizsgálata BAL FACS analízis Szérum IgE mérés Génexpressziós vizsgálatok Légúti túlérzékenység mérése 4.3.2. Asztma modellek A leggyakrabban alkalmazott asztma modell kis állatok (nyúl, tengerimalac, egér) ovalbuminnal (OA, szintetikus tojás fehérje) történő szenzitizálása. Különböző patkánytörzsek pulmonális reakciói között jelentős eltérések lehetnek, melyek a törzsek légúti simaizom mennyiségében lévő különbségekből adódnak. Nagy állat modelleket (majom, juh, kutya) ritkábban alkalmaznak.58 Először OA intraperitoneális vagy szubkután injekciójával szenzitizálják az állatokat. Adjuvánsként Al(OH)3-t adnak, mely elősegíti az antitest reakció kialakulását. Majd, a kezelést 7 nappal később megismétlik. Újabb 7 nap múlva, az állatok porlasztó segítségével legalább 7 napig naponta OA kezelést kapnak aerosol formájában. A szenzitizálás biokémiai és fiziológiai hatását, és légzésmechanikai (bronchiális provokációs teszt) következményeit vizsgálják, valamint differenciált (eosinophil, leukocita, granulocita, és vörösvértest) sejtszámlálást végeznek a BAL-ból. A szenzitizálás sikeressége az OA intravénás beadásával ellenőrizhető.

Az allergiás folyamat főbb szereplői endothel-VCAM-1

T sejtek (limfociták) szerepe Az egész asztmatikus folyamat legfontosabb szereplői T sejt hiányos egéren nem lehet asztmát előidézni Th1 citokinek : INFg, IL-12, IL-18, TNFa Th2 citokinek: IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-9, IL-10. Th2/Th1 egyensúly eltolódása: az asztma Th2-es betegség Nélkülözhetetlenek: CD4+ T sejtek, MHCII, CD28 SCID: severe combined immunodeficiency: nincs T sejtje, és B sejtje: genetikai manipulációval állítják elő: allergén, vagy más provokáció hatására nem lesz asztmás

SCID egértüdő +OVA kezelés SCID egértüdő + OVA + Th2 sejtek SCID egértüdő + OVA + Th1 sejtek SCID egértüdő+OVA+Th1+Th2 Histologic examination of lungs from SCID mice receiving Th1, Th2, and Th0 cells. (a) Lung tissue from control SCID mouse that received intranasal OVA but no Th cells. H&E, ´250. Inset: High-power magnification of normal bronchiolar epithelium. H&E, ´400. (b) Lung tissue from SCID mouse that received Th2 cells and intranasal OVA. Peribronchiolar mononuclear cell infiltrates are noted. The airway lumen is filled and expanded by thick mucus. H&E, ´250. Inset: High-power magnification of the airway epithelium showing tall columnar cells exhibiting abundant cytoplasmic mucin and a collarette of inflammatory cells. H&E, ´400. (c) Lung tissue from SCID mouse that received Th1 cells and intranasal OVA. Dense peribronchiolar inflammatory infiltrates are seen. The airway lumen does not contain mucus plugs. H&E, x250. Inset: Lymphocytes are penetrating the airway epithelium and surrounding tissue spaces. H&E, x400. (f) Lung tissue from SCID mouse that received both Th1 and Th2 cells and intranasal OVA. Significant airway inflammation is noted, without airway mucus. H&E, x250. Inset: The epithelium displays reactive-appearing columnar cells, with inflammatory cells at the bases. H&E, x400. H&E, hematoxylin and eosin; SCID, severe combined immunodeficiency.

Légúti hiperreaktivitás SCID egerekben intravénás Th0, Th1 és Th2 és intranazális OVA adása után. AHR csak a Th0 és Th2 sejtek injektálása után figyelhető meg. Th2 and Th0 cells, but not Th1 cells, increase airway hyperreactivity. SCID mice received Th1, Th2, or Th0 cells (2.5 x 106 cells per mouse) intravenously plus intranasal OVA. Control mice received either OVA only or cells only. Three days after adoptive cell transfer, airway hyperreactivity in response to increasing concentrations of inhaled methacholine was measured in a whole-body plethysmograph. Data are expressed as percent above baseline (mean ± SEM); n> 7 for each data point. Cell transfer without intranasal administration of OVA had no effect on airway hyperreactivity (data not shown).

Eozinofilek szerepe Szintje szinkronban van az asztma súlyosságával granulumok: hisztamin, különböző enzimek (RNáz, DNáz) , MBP (major basic protein) : fő mm. károsító fehérje-emberben! Egérben MBP nélkül is AHR - hisztamin felszabadítás hízósejtekből, bazofilekből - alveoláris makrofágok aktiválása - epitéliális sejtkárosítás

Effektor hatásán túl immunválasz moduláló hatása is van: termelhet mind Th1, mind Th2 citokineket, befolyásolja APC-ként is a Th2 sejtek működését. CCR3 kemokin receptort tartalmaz Fő kemoattraktánsai: eotaxinok, RANTES, MCP-k

Hízósejtek (masztociták) szerepe Azonali allergiás reakció Hízósejt hiányos egér (allergén kezelés után): korai AHR nincs, késői AHR viszont van Hízósejt degranuláció http://www.opt.pacificu.edu/ce/catalog/13890-AS/Fig%202.jpg IL-4, IL-5, IL-9 TNFa + leukotriének, prosztaglandinok Th2 Késői allergiás reakció

A hisztamin szerepe allergiában és asztmában Hízósejtek és a bazofilek termelik. A hisztamin a korai asztmatikus reakció tünet- együttesének fontos mediátora. Simaizom kontrakció Érpermeabilitás Vazodilatáció Mucus szekréció A plazma hisztamin koncentrációja korrelál az asztma súlyosságával. H1 receptor antagonisták szerepe Hisztidin dekarboxiláz: hisztamint szintetizál; HDC KO egér: nincs endogén hisztaminja

Légzésfunkciós vizsgálatok: hisztamin hiányos (HDC KO) egereken OVA kezelés hatására szignifikánsan kisebb AHR alakul ki HDC KO kezelt WT kezelt

Tüdő-szövettani vizsgálatok A HDC KO egerek tüdeje OVA kezelés hatására alig különbözik a placebóval kezelt állatokétól WT allergizált KO allergizált placebo

B-limfociták Th2 IgE http://letempsdescerises.blogspot.com/2005/07/da-imunidade_01.html

IgE szerepe Fontos szerep a hízósejtek aktiválásában, és az azonnali allergiás reakciókban. Két receptor: nagy affinitású: FceRI; kis affinitású: CD23(FceRII) Ag-specifikus IgE, szenzitizált egereken AHR-t vált ki: FceRI KO egereken nem, CD23 KO-n igen T sejt KO egereken Ag-spec IgE nem okoz eozinofiliát és AHR-t. Ezeket IL-5-tel lehet visszaállítani. B sejt hiányos egereken légúti Ag szenzitizálás T sejt aktiválást és Th2 citokin termelést és eozinofiliát okozott, de nem volt AHR. Szisztémás Ag szenzitizálásnál volt AHR is: IgE nem létfontosságú az asztmában

Allergénnel kezelt, asztmatikus WT (A,B) és IgE hiányos (C,D) állatok tüdeje „asztmásítás” után nem különbözik egymástól: IgE-nek nincs létfontosságú szerepe az asztma kialakulásában egerekben.Eozinofilek és limfociták infiltrációja figyelhető meg perivasculárisan és peribronchiálisan. Br, bronchiole; Placebo Allergénnel kezelt, asztmatikus WT IgE KO

Gyulladásos sejtek infiltrációja a tüdőben WT és IgE hiányos egereken: allergén kezelés (Af) után nincs szignifikáns különbség IgE KO egér

IL-4 szerepe Th0 sejtek differenciálása Th2 sejtekké B sejt átkapcsolása IgE termelésre Endothel sejtek VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule) termelését (mRNS) erősíti (ez szükséges az eozinofilek szövetbe történő infiltrációjához) Epithel sejtek eotaxin termelését fokozza: eozinofilek odavonzása Hízósejt érés kofaktora IL-4 szerepe endothel-VCAM-1

IL-4 KO egér (C57BL/6 törzs) OVA kezelés után nincs IgE, légúti eozinofilia, AHR OVA spec. IgE adagolás: nincs légúti eozinofilia, AHR IL-5 adagolás: légúti eozinofilia, AHR kialakul Az IL-4 legfontosabb szerepe: szenzitizáláskor Th2 irányba tolja el az immunválaszt, elősegítve így az IL-5 termelést. Egértörzsenként különböző eredmények: BALB/c IL-4 KO egerekben kialakulnak az asztmatikus tünetek (AHR) OVA hatására: más a patomechanizmus ebben az egértörzsben IL-13, IL-4R, STAT6 szerepe

IL-5 szerepe Eozinofilek érését, csontvelőből való kiáramlását serkenti, növeli életképességét, érzékenyíti kemotaktikus mediátorokra, erősíti a citotoxicitását és az endothélhez való adhézióját. endothel-VCAM-1 IL-5 transzgenikus egérben (a tüdő epitél sejtekben, Clara cell 10 gén (CC10) promótere után) magas az eozinofilszám és súlyos asztma alakul ki.

IL-5 túlexpressziója a tüdő epitél sejtjeiben IL-5 túlexpressziója a tüdő epitél sejtjeiben. a: WT egér, b,c,d: IL-5 transzgenikus egér; b,c, d: a légutak csaknem blokkolva vannak a megduzzadt peribronchiális szövetektől B, bronchiole; PV, pulmonary blood vessel; AS, alveolar space; BALT, bronchus-associated lymphoid tissue.

Sejtszámok a tüdőben Üres négyzet: vad, fekete négyzet: IL-5 Tg egér.

IL-5 szerepe Eozinofilek érését, csontvelőből való kiáramlását serkenti, növeli életképességét, érzékenyíti kemotaktikus mediátorokra, erősíti a citotoxicitását és az endothélhez való adhézióját. Anti-IL-5 Ag provokálás (Ag belélegeztetés) előtt megakadályozta az eozinofíliát és az AHR-t IL-5 KO állat: normális IgE és T sejt válasz, de nincs eozinofilia és AHR

IL-5 és IL-4 KO egereknél nincsen fokozott AHR (C57BL/6)

IL-5-tel (AV5) igen, IgE-vel nem lehet visszaállítani a fokozott AHR-t IL-4 KO egerekben (IL-4 (AV4) adásával is kialakul az AHR)

IL-13 szerepe Közös receptor alegység az IL-4-gyel (IL-4Ra) Mucus termelést, AHR-t és eotaxin termelést erősíti, transzgenikusan: AHR-t okoz endothel-VCAM-1

WT (wild type) és IL-13 transzgén egér légútjai Ag provokáció nélkül vs provokáció után

IL-13 szerepe Közös receptor alegység az IL-4-gyel (IL-4Ra) Mucus termelést, AHR-t és eotaxin termelést erősíti, adagolása AHR-t okoz IL-13 függő pathomechanizmus Elnyomja az IL-5 expressziót IL-13 KO egér (allergén szenzitizálás és provokálás után): csökkent eozinofilia, mucus, légúti gyulladás, AHR IL-13 neutralizálása hatásosabb, mint az IL-4-é

Mucus termelő sejtek száma a bronchusok epitéliumában WT és IL-13 KO állatokban

IL-9 szerepe T sejtek növekedési faktora, B sejtek érését és a hízósejtek proliferációját elősegíti. endothel-VCAM-1

bronchus epitélsejtjei nagyobbak (hipertrófia) mucus képződés, IL-9 TG-egér (IL-9 a CC10 promóter után: IL-9 túlexpressziója a tüdő epitéliumában) : tüdő eozinofil szám bronchus epitélsejtjei nagyobbak (hipertrófia) mucus képződés, hízósejtek az epitéliumban (kontrollokéban nem) De alacsony hisztamin: hízósejtek nem degranulálódtak!!! kontroll TG

IL-9 KO egér: nem különbözött a kontrolltól: Ugyanúgy kialakult OVA kezelés hatására az AHR, légúti eozinofília stb. Az IL-9 szerepét átvették más citokinek. Pl.: IL-13: mucus termelés, IL-4, IL-5: eozinofil toborzása, hízósejt érés stb.

Asztma kialakulásának három lehetséges útja Hisztamin leukotriének

Kemokinek

Kemokinek szerepe Eotaxinok Receptoruk: CCR3; Vonzzák: eozinofileket, Th2-t Eozinofilek degranulációja Eotaxin -/-: OVA szenzitizálás és provokáció után: hasonló AHR és eozinofilia mint a WT-ban: más kemokinek átveszik szerepét. MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) Receptora: CCR2; Vonzza: monocitákat, (aktivált eozinofil), Bazofil degranuláció, Th2 polarizáció RANTES Receptor: CCR1,3,5; Vonzza: eozinofileket Bazofil degranuláció, IgE termelés fokozása MIP-1a, MCP-3,4, MDC, IP-10 stb.

CC kemokin receptor 3 (CCR3) és az asztma eozinofilek, hízósejtek, bazofilek, Th2 sejtek felszínén kemokin receptor: eotaxinok, RANTES, MCP-2,3,4, MIP-1a receptora Fontos szerep az eozinofilek kemotaxisában és a Th2 sejtek toborzásában OVA kezelt CCR3 KO: csökkent légúti eozinofília, de AHR volt

Eozinofilszám a tüdőben vad (üres hasáb) és CCR3 KO egér tüdejében és BAL-jában placebo (sham) és OVA kezelés után

KO állatban az eozinofilek a vérerekben maradtak az endothel sejtek alatt, míg a WT állatban beáramoltak a tüdőszövetbe a T sejtekkel együtt. De 4-12x annyi hízósejt, és emelkedett AHR a CCR3 KO állatban vs WT: -/- +/+

Transzkripciós faktorok szerepe: T-bet a Th1-es, GATA-3 a Th2-es immunválasz fő transzkripciós faktora

Humán eredmény: Asztmások tüdejében alacsonyabb a T-bet expresszió, mint nem-asztmásokban. Előállítottak T-bet hiányos egereket. Az egereken spontán, a humán krónikus asztmához hasonló állapot alakult ki.

Már a T-bet szint 50%-os csökkenése is spontán (allergén-indukció nélküli) AHR-t vált ki: a Th1/Th2 egyensúly eltolódása Th2 irányba asztmát válthat ki.

Eozinofilek és limfociták perivaszkuláris és peribronchiális infiltrációja, kollagén lerakódás a légutak körül, simaizomsejtek hiperpláziája (remodelling) a T-bet -/- egerekben

GATA-3 génexpresszió szintje egészséges és asztmás emberek tüdejében

GATA-3 szerepe asztmában Szintje emelkedik az asztmások tüdejében GATA-3 KO: letális magzati korban, indukált deléció T sejtekben: OVA szenzitizálás és provokáció után: nincs légúti eozinofilia, AHR, és IgE válasz

Antisense GATA-3 (AS-GATA3) kezelés megszünteti egéren az OVA indukálta asztmatikus tüneteket OVA kezelés hatására a légutak mucussal eltömődnek, és gyulladások sejtek infiltrálódnak a tüdőbe A nonsense DNS (NS) kezelésnek nincs hatása: gyulladásos sejtek a tüdőben AS-GATA3 kezelés: megszünteti a mucus termelést és a gyulladást

GENOMIKA

Multifaktoriális betegség Például: allergiás betegségek, asztma, rák, magas vérnyomás, cukorbetegség, kardiovaszkuláris betegségek. Gyakoriak (vs. monogénes betegségek). Pl.: asztma gyakorisága 6-10%, kardiovaszkuláris halál az összes halál ok 39%-a. Családi halmozódás, de nem mendeli öröklődés. Általában gyakoribbak a poszt-reprodukciós korban: nincs kiszelektálódás A gyakori multifaktoriális betegségek kezelése óriási pénzeket emészt fel. Pl.: kardiovaszkuláris betegségek: USA >100 milliárd $/év, asztma 11 milliárd $/év.

Az öröklődés vizsgálata Eredmények Szegregációs analízis Egyik szülő sem atópiás: a gyermekek 11-13%-a; mindkét szülő: a gyermekek 50-70% igen Magyarország: Az asztmások gyerekeinek 26,7% atópiás (leggyakrabban asztmás) Ikervizsgálatok: Egypetéjű ikreknél az asztma konkordanciája: 26-75% Testvérvizsgálatok: Asztma λs=2,0, bár egyes populációkban magasabb: λs>7 (atópiás allergia:2 alatt szubfenotipus!)

Családi halmozódás összehasonlítása a populációs gyakorisággal: lR érték: a betegség esélye az R rokonban osztva a betegség esélyével (gyakoriságával) a teljes populációban. Leggyakrabban használt: ls; s= sib (ált. monozigóta) Minél nagyobb a lR érték 1-nél, annál nagyobb a genetikai hányad a jellemzőben (betegségben). lR =1 azt jelenti, hogy a jellemzőnek nincs öröklődő hányada.

Az öröklődés vizsgálata Eredmények Szegregációs analízis Egyik szülő sem atópiás: a gyermekek 11-13%-a; mindkét szülő: a gyermekek 50-70% igen Magyarország: Az asztmások gyerekeinek 26,7% atópiás (leggyakrabban asztmás) Ikervizsgálatok: Egypetéjű ikreknél az asztma konkordanciája: 26-75% Testvérvizsgálatok: Asztma λs=2,0, bár egyes populációkban magasabb: λs>7 (atópiás allergia:2 alatt szubfenotipus!) Founder populációk (finn, észt, Amish, Hutterite)

Az atópiára való hajlam kockázata azokban a gyermekekben sokszor nagyobb, akiknek az anyja atópiás. Magyarázatok: anya-magzat immunológia egymásra hatása a terhesség alatt, illetve a szoptatáskor genetikai imprinting, azaz azok közül a gének közül, amelyek az atópiára hajlamosítanak inkább az anyaiak fejeződnek ki.

Multifaktoriális betegségek genomikai hátterének tisztázását nehezítő jellemzők Fenokópia: Kizárólag környezeti hatások ugyanazt a klinikai képet eredményezik, mint a genetikai tényezők Pleiotrópia: Ugyanaz a mutáció a környezet hatására más klinikai képet eredményezhet. Nehéz a pontos diagnózis: Életkorral változhat a klinikai kép A tünetek epizódokban jelentkezhetnek Más betegség hasonló tünetekkel A különböző betegségek gyakran együtt fordulnak elő. endofenotípusok!!

Óriási erőfeszítések, kevés siker. Miért? Rengeteg gén + rengeteg, egész életen át tartó környezeti faktor egymásra hatásának populációs eloszlása adja a betegség populációs eloszlását. Egy egyén genotípusának teljes ismeretéből sem lehet megmondani teljes bizonyossággal a betegsége kezdetét, lefolyását, vagy a súlyosságát. Valószínűséget/kockázatot lehet mondani. Egy adott időpontban a fenotípust meghatározza az adott környezet és a genotípus egymásra hatása, amit befolyásol a korábbi környezetek és a genotípus interakciójából származó fenotípus. Egyes génvariációk hatása nagyon kicsi populációs szinten: nagy mintaszám szükséges, növekszik a heterogenitás, csökken a kockázati faktor. A betegséget okozó mutáció sokszor nem fehérjekódoló génben van, hanem szabályozó régióban. Ezt sokkal nehezebb megtalálni, hiszen jelenleg csak kevés szabályozó régiót ismerünk (ld. Junk DNS)

QTL vizsgálat egerekben QT-QTL Egér vizsgálatok QTL vizsgálat egerekben QT-QTL A beltenyésztett egértörzsek közötti mérhető fenotípusos jellegekben különbségek vannak. Keresztezésekkel és visszakeresztezésekkel ezek nyomonkövetése, majd a különbséget okozó genetikai háttér tisztázása.

QTL vizsgálat egerekben Kongenikus törzs létrehozása: olyan (pl. egér)törzs amely a fenotípusra „nem hajlamos” törzstől csak a hajlamosító régióban különbözik. Mindig a QT-t hordozót kell visszakeresztezni a QT-t nemhordozó szülői egértörzzsel.

QTL vizsgálat egerekben Kongenikus törzs létrehozása: olyan (pl. egér)törzs amely a fenotípusra „nem hajlamos” törzstől csak a hajlamosító régióban különbözik. Mindig a QT-t hordozót kell visszakeresztezni a QT-t nemhordozó szülői egértörzzsel. A QTL-t genomszűréssel meghatározni, további markerek segítségével finomítani. Elérhető felbontás kb. 1 cM. Pozicionális jelölt gének keresése. Humán ortológ keresése. Asszociációs vizsgálatok.

PBS-sel, vagy OVA-val kezelt egerek AHR 3 asztmára jellemző fenotípus (AHR, eozinofil szám, IgE szint) összehasonlítása különböző egértörzseken melyeket ovalbuminnal illetve semleges pufferrel (kontroll állatok) kezeltek. A/J C3H/Hej Különböző egértörzsek BAL eozinofil szám IgE szint Susan L. Ewart, Quantitative Trait Loci Controlling Allergen-Induced Airway Hyperresponsiveness in Inbred Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 23, pp. 537–545, 2000.

A/J egerek: legmarkánsabb asztmatikus tünetek; C3H/HeJ: legrezisztensebb az asztmával szemben ENNEK MI AZ OKA? QT: AHR QTL tanulmányozása az F2= A/J x (C3H/HeJ x A/J)F1 backcross egereken

AHR összehasonlítása 3 egérpopulációban; F1 = A/J x C3H/HeJ

AHR eloszlása különböző egértörzsekben 164 mikroszatellita marker, 10 cM felbontás.

LOD score csúcsok a 2-es kromoszómán QT: allergén indukálta AHR 2 különálló LOD csúcsot detektáltak (szaggatott vonal) LOD = logarithm of odds, annak az esélynek a 10-es alapú logaritmusa, hogy két lókusz genetikailag kapcsolt, összehasonlítva annak az esélyével, hogy nem kapcsolt. Pl. LOD = 3 azt jelenti, hogy 1000x-es (103x) a valószínűsége annak, hogy két lókusz együtt öröklődik, mint annak, hogy nem (0 hipotézis). (A LOD score =3 felel meg a p=0,05-ös valószínűségnek.)

Humán homológok: 1: D2Mit359–D2Mit416 neve: Abhr1, LOD: 4,2; humán homológok: 10p11-13, 2q12-q14,9q22-q34: GATA-3, IL-1R antagonista 2: D2Mit238–D2Mit298 neve: Abhr2 LOD: 3.7, humán homológok: 9q33-q34, 2q14-q24: prostaglandin synthase 1 3: D7Mit21–D7Mit56 , LOD: 1,9, humán homológ: 19q13: IL-11

Jelölt gének -GATA-3, IL-1R antagonista -ProstaglandinE2: asztmások tüdejében emelkedett a szintje, simaizom proliferációt (remodelling) és eozinofilek túlélését fokozza. PGD2: hízósejt termeli, lipid mediátor, macrophage-derived chemokine (MDC)-t indukálja, ami kemoattraktánsa a Th2 sejteknek. -IL-11: B sejtek Ig termelését stimulálja, túlexpressziója megnövekedett légúti ellenállást okoz

Oligonukleotid-microarray High responderek low-responderek A/J C3H/HEJ BC1-high BC1-low 21 gén eltérő expresszióval: C5 gén, ami az Abhr2 közelében van alacsony expresszió magas SNP genotipizálás Homozigóták(D/D) 2bp deléció heterozigóták 5.exonban

C5: komplement faktor 5 pleiotróp hatás Milyen szerepe lehet asztmában? C5R-antagonista IL-12 TNFα C5:IL-12 Th1

Humán vizsgálatok Teljes genomszűrés Asszociációs vizsgálatok Pozícionális klónozás

Teljes genomszűrés Eddig: 16 szűrés 12 populáción 20 régióval találtak kapcsolatot Mikroszatelliták

Asztma genomszűrések eredményei

Példa genomszűrésre MARIE-HÉLÈNE DIZIER, et al Példa genomszűrésre MARIE-HÉLÈNE DIZIER, et al. Genome Screen for Asthma and Related Phenotypes in the French EGEA Study Am J Respir Crit Care Med Vol 162. pp 1812–1818, 2000 Epidemiological Study on the Genetics and Environment of Asthma, Bronchial Hyperresponsiveness, and Atopy (EGEA): francia genomszűrés 107 „nukleáris” családot vizsgáltak, ahol legalább 2 testvérnek volt asztmája (493 résztvevő): sib pair analízis 254 mikroszatellita marker, 13 cM felbontás 2 lépcsős stratégia: 46 család először, 70% markerrel 61 család másodszor QT: bőrallergia teszt (skin prick teszt), IgE, eozinofilszám, bronchial responsiveness

11-es kromoszó-ma; IgE szint 17-es kromoszó-ma, asztma

Jelölt gének Asszociációs vizsgálatok

Asszociáció egy statisztikai kijelentés: az adott allél szignifikánsan gyakrabban fordul elő együtt az adott fenotípussal, mint az várható. SNP-k! Pozitív asszociáció oka lehet: Direkt hatás: a vizsgált allél okozza a betegséget LD: kapcsoltság van a vizsgált marker és a betegséget okozó gén között. Természetes szelekció. Az illető allél megnöveli a túlélés esélyét a tanulmányozott betegséggel szemben Populációs rétegződés (population stratification): egyes népcsoportokban bizonyos allélok gyakrabban fordulnak elő. Pl. evőpálcika gén (HLA-A1 gyakoribb a kínaiakban)

Pozitív asszociáció oka lehet (folyt.) Statisztikai hiba (egyes típusú): a kérdések számával korrigálni kell a p-t. P=0,05 azt jelenti, hogy 95% a valószínűsége hogy az allél asszociál a kérdéses betegséggel.Megfordítva: 5%, ami azt jelenti, hogy 20 vizsgálatból csak egyszer tévedünk. De ha 50 allélt vizsgálunk akkor már nagy az esély, hogy hamis pozitívat is kapunkBonferroni korrekció: a szükséges p = 0,05/a kérdések száma.

Population admixture: (hozzákeveredés) Olyan populációkat vizsgálunk együtt, akik különböző genetikai háttérrel rendelkeznek (Pl.: afrikai, fehér: magas vérnyomás): az egyes populációkra a betegséget okozó specifikus genetikai variációk elveszhetnek (felhigúlnak). Vagy: a vizsgált populációban vannak olyanok, akik kevert genetikai háttérrel rendelkeznek (pl.: kaukázusi “fenotípusú” fekete (afrikai) nagymamával, vagy roma egyén akinek ősei között kaukázusiak is voltak, stb. Kontroll csoport megválasztása nagyon fontos: ugyanolyan populációs rétegződéssel kell rendelkeznie (etnikum, nem, kor, környezet stb.) mint a betegcsoportnak.

Amish –szegregációs analízis, IgE, Eos.

5q31-q33 IL-4, IL-13: B sejtek switch  Th2 válasz kiváltása Az IL-4 gén közelében elhelyezkedő mikroszatellita marker és a nem-specifikus (össz) IgE szint között szoros összefüggést találtak. IL-4-589*T homozigótaságot asztmával, rhinitissel és atópiával hozták összefüggésbe. Az IL-13 több polimorfizmusa asszociált emelkedett IgE szinttel. promoter régió: –1111 :szignifikáns kapcsoltságot mutatott asztmával, légúti hiperreaktivitással és pozitív bőrpróbával. IL-13 Arg110Gln: erősebben kötődik receptorához, emelkedett IL-13 és IgE szint, asztma.

IL-13 Arg110Gln polimorfizmus szignifikánsan gyakrabban (P=0,007) fordul elő asztmában (Th2-es betegség), mint juvenilis arthritisben (JIA, Th1-es betegség)

5q31-q33 IL-5: Eozinophil felszabadítása a csontvelőből, eotaxin (eozinofil kemoattraktáns) termelés fokozása  Asztma, bronchiális hiperreaktivitás, SNP-t nem találtak. IL-9: T sejt proliferáció, hízósejt differenciálódás és proliferáció. CD14: Bakteriális LPS kötő receptor

Gram negatív baktérium sejtmembránja és sejtfala LPS szerkezete

CD14: Bakteriális LPS kötő receptor Szerepet játszik a Th1/Th2 egyensúly kialakulásában. CD14 kötés IL-12 termelést vált ki  élet korai szakaszában Th1 válasz kialakulása. -159 C/T polimorfizmus: „TT”: Nő a sCD14 szint (s= solubilis), nő a CD14 sűrűség monocitákon, csökken az IgE szint (vs „CC”).  Th1 irány. A CD14-LPS kapcsolat magyarázhatja a gyermekkori fertőzés és az atópia közötti inverz kapcsolatot.

TIM1-TIM3: Receptorok, befolyásolják a Th1 (TIM3) és Th2 (TIM1) sejtek kialakulását. TIM1: Hepatitis-A vírus receptora is. Vírusfertőzés véd az asztma ellen.

6p21.3 MHC tartomány: MHC II (HLA-D): allergénpeptidek prezentációja a “jobb” vagy “rosszabb” bemutatás, más citokineket termelő Th sejtek aktivációját, tehát erősebb vagy gyengébb allergiás immunválaszt eredményez. Parlagfű Amb5 allergénjére reagáló fehérek 97,5%-a: DR2.2; nem reagáló: 22% DR2.2; (Amb6, Der1 (poratka allergénje) és a Der2-vel kapcsolatban is találtak hasonlókat.) TNFa: Gyulladási választ közvetítése  Asztma TNFa -308 G/A promóter polimorfizmus: ‘A’ allél  magasabb expresszió és TNFa szint

11q13 FcεRI-β: bazofil, Ds, hízósejt Ile181Leu: Atópia, asztma (?) Glu237Gly: asztma, BHR (?) Anyai öröklődés CC16

CC16 Clara cell protein 16: bronchusokban szekretálódik, BAL összfehérjéjének 7%-a, légúti gyulladást szabályozza. CC16 KO egér: fokozott gyulladási válasz. 38A/G polimorfizmus az 1.exon nemkódoló régiójában. 38AA 6,9x, 38AG 4,2x asztma kockázat.

16p21 IL-4R: IL-4-nek (és az α alegység az IL-13-nak is) receptora  Atópia, asztma Ile50Val (I75V, ha a szignálpeptidet beleszámolják) az extracelluláris doménben helyezkedik el, valin esetén a receptor erősebben köti az IL-4-t. (R) A Glu576Arg a jelátviteli intermedierekhez való kötődést változtatja meg. (D) Mindkét esetben a receptor felerősödött jelátvitelét tapasztalták. Haplotípusban a legerősebb a hatás (V50-R576)

IL-4-re adott válasz nagysága

17q11.2 Kemokinek: eotaxin, RANTES, MCP-1: Leukociták gyulladáshoz vonzása  Asztma, AEDS Eotaxin: 67 G/A ala/thr asztmára való hajlam: - betegség súlyossága: + „A”: csökkent az eotaxin szekréció alacsonyabb az eozinofilszám és jobbak a tüdőfunkciós értékek.

Rantes -403 C/G AEDS, asztma, -28 G/A súlyos asztma (Japán és kínai populációk) MCP-1 -2518 A/G: magasabb MCP-1 expresszió a G alléllel. (CCR2-MCP1 Th0 Th2)

MCP-1 -2518 A/G vizsgálata asztmában és allergiában MCP-1 -2518 A/G vizsgálata asztmában és allergiában. A -2518 G allél szignifikánsan gyakrabban fordult elő asztmásokban, mint nem-asztmásokban (34,4% vs 21.1%) Szalai C, Kozma GT, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polymorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 2001 Sep;108(3):375-381.

“Asztma-gének” azonosítása pozícionális klónozással

Teljes genomszűrés után a jelölt régió szűkítése sűrűbben elhelyezkedő mikroszatellita markerekkel (szokásos QT-k: IgE, AHR) A leszűkített jelölt régióban SNP-k keresése (pl. 5 beteg-5 egészséges megszekvenálásával) LD-k keresése az SNP-k között: haplotípusok azonosítása Haplotípusok asszociációs vizsgálata különböző populációkon asztmával (pl.: TDT)

A leszűkített, asszociáló területen gének keresése adatbankokban Gének expressziójának vizsgálata egér tüdőben (pl. asztmás vs egészséges) Kiválasztott gén(ek) funkcionális vizsgálata

20-as kromoszóma Van Eerdewegh P. és mtsai. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. Nature. 2002; 418: 426-30. 460 asztmás testvért tartalmazó család teljes genomszűrése, majd a legmagasabb LOD értéket mutató régióban jelölt régió asszociációs vizsgálat. A használt QT-k: asztma, BHR, asztma+ IgE

Linkage analysis and gene content of chromosome 20p13 Linkage analysis and gene content of chromosome 20p13. a, lod score plots for four phenotypes: asthma (red), asthma and BHR (black), asthma and total IgE (blue) and asthma and specific IgE (green).

1 LOD score esés: 95% CI: 4,28cM = 2,5 Mb 40 gén azonosítása 23 génben 135 SNP összehasonlítása 130 IBD és 230 kontroll-ban. 5 SNP ami asszociációt mutatott: megerősítés TDT teszttel a teljes populációban (2000 páciens) 8 haplotípus asszociált asztmával Különböző populációkban (Afrikai amerikai, US fehér, US spanyol, holland fehér, UK, német) más SNP-k és más haplotípusok asszociáltak asztmával. ADAM33 asszociált: 185kb LD intervallum

ADAM33 expressziója a tüdő különböző sejtjeiben RT–PCR analysis of the expression of ADAM33 in five different lung primary cell types and whole lung. Marker, 100-bp ladder. Lanes containing primers from ADAM33 are labelled a, lanes containing primers from the ORF of b-actin are labelled b.

ADAM33: -Zn-függő metalloproteináz, -tüdőben, a simaizmokban és a fibroblastokban expresszálódik. Bár pontos funkciója még nem tisztázott, feltételezik, hogy szerepet játszhat a bronchusok kontraktilitásában és/vagy befolyásolhatja a bronchiális remodelling folyamatát.

Genomszűrés eredménye a 6p21-es régióban Ezek a gének találhatók ebben a régióban HLA-G gén: új asztmagén (2005) pozícionális klónozással

HLA-G Fő szerepe: gátolja a magzat kilökődését terhességben Gátolja a Th1-es immunválaszt -964 A/G: -964 AA gyerekek 60% atópiás, a GG gyerekek 41% atópiás -964 GG gyerekek akkor hajlamosak bronchiális hiperreakcióra, ha az anyjuknak is van. Asztmás anyák, -964 GG gyerekek 56%-a volt asztmás nem asztmás anyák GG gyerekeinek 26%-ának volt asztmája. Az apákkal nem volt ilyen összefüggés.

Gén-környezet kölcsönhatás Susan Colilla, et al. Evidence for gene-environment interactions in a linkage study of asthma and smoking exposure. J Allergy Clin Immunol 2003;111:840-6.

Csecsemőkori passzív dohányzás Probléma A dohányfüst expozíciónak kitett csecsemőkben nőtt-e a későbbi asztma kialakulásának kockázata, és ha igen, azt milyen kromoszómarégiókon található gének befolyásolták? Gyermekkori asztma Csecsemőkori passzív dohányzás Genetikai markerek? Legmagasabb LOD? ?

Módszer Collaborative Study for the Genetics of Asthma (CSGA); USA-fehéreket vizsgált 144 család, melyben legalább egy asztmás testvérpár van, több család 3 generációs. Kérdés dohányzott-e valaki a családban amikor kisbaba volt? 323 markert vizsgáltak autoszómákon

Eredmények/válasz Az asztmások 38%-ának volt dohányzó szülője. USA-ban a dohányzás prevalenciája kb. 25%.

Eredmények/genomszűrés Gyermekkori asztma - Csecsemőkori passzív dohányzás - Genetikai markerek? Legmagasabb LOD? ? 1p 5q 17p b2-AR,IL-4,IL-13

Gén-környezet asszociációs vizsgálat (dohányzás-asztma) 5q32: b2 adrenerg receptor: stimulációja bronchodilatáció Eredmény: Arg16Gly: asztmások 46%, kontrollok 28% arginin homozigóta Az arginin-16 homozigóta dohányzóknak közel 8-szoros az esélyük arra, hogy asztmásak legyenek, összehasonlítva a nemdohányzó glicin-16 homozigótákkal.

b2 adrenoreceptor gén polimorfizmus és az elszívott doboz cigaretta mennyiségének hatása az asztma kockázatára. Minél többet dohányzik az arg-16 homozigóta, annál nagyobb az esélye, hogy asztmás lesz. A többi genotípusúnál nem volt ilyen összefüggés. (*jelenti a szignifikáns különbséget)

Magyarázat: Arg: magasabb receptorszám De! Jobban reagál dohányfüstre (b2 agonista kezelésre). Hatása vsz. a receptorszám downregulációja. (gly/gly szint alá)