Kísérleteinkkel beállítottuk és validáltuk a fág display módszert monoklonális antitestek epitóp térképezésének az elvégzéséhez. A továbbiakban ezen a módon az OBEKON projekt keretében létrehozott, a kóros elhízás kialakulásában szerepet játszó, illetve azt jelző marker fehérjéket felismerő, antitestek epitóp térképezését fogjuk végezni. A diagnosztikában felhasználható epitóp meghatározása mellett az epitóp szekvenciája alapján mód nyílhat fehérje adatbázisokban végzett kereséssel a kóros elhízás kialakulásában szerepet játszó ismeretlen fehérjék meghatározására. Fág display rendszer validálása obezitás specifikus monoklonális ellenanyagok epitóp térképezéséhez Varga János, Nagy Zsuzsanna, Hajdú István Lőrincz Zsolt, Cseh Sándor TargetEx Kft., H-2120 Dunakeszi Kápolna köz 4/A Bevezetés Eredmények Módszerek Diszkusszió Referenciák O B E K O N A munka során alkalmazott módszer a fág display volt, amely egy elterjedt technika a fehérje-fehérje, peptid-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára (1). A peptideket egy bakteriofág (M13) burokfehérjéjéhez (pIII) fuzionáltan jelenítjük meg a virion felszínén. A peptideket megjelenítő fágokból nagy méretű könyvtárakat lehet létrehozni, amelyekből in vitro szelekcióval kiválaszthatók a target molekulához jól kötődő peptideket hordozó fágok (2). Ezeknek a peptideknek a szekvenciája a fágok DNS-ének szekvenálásával meghatározható. Az epitóp térképezéshez használt random peptid könyvtár a Ph.D.-12 (Phage Display Peptide Library Kit, New England Biolabs) volt. Az elméleti könyvtárméret 4.1x10 15, a valódi komplexitás 2.7x10 9 volt. A szelekciós körökben 1.5x10 11 pfu (plaque forming unit) mennyiségű fágot használtunk. A fág display lépései Target immobilizáció A target fehérjét hordozón (96 lyukú, MaxiSorp felületű mikrotiter lemez, Nunc) immobilizáljuk, és a nem specifikus kötődés elkerülése érdekében kazeinnel blokkoljuk a szabad felületet. Szelekció A target fehérjéhez hozzáadjuk a fág könyvtárat és inkubáljuk. A nem kötődött fágokat mosással, a kötődött fágokat nem specifikus elúcióval (200 mM glicin, pH=2,2) távolítjuk el a targetről. Az eluált fágok mennyiségét titrálással határozzuk meg. forrás: Amplifikáció Az eluált fágokkal E. coli ER2738 baktériumsejteket transzfektálunk. Az amplifikáció után a termelt fágokat tisztítjuk, és ezzel végezzük el a következő szelekciós kört. Általában három kör elegendő megfelelő dúsúlás eléréséhez. Klónok izolálása Az affinitás érés ellenőrzéséhez egyedi plakkokról klónokat izolálunk. ELISA Az egyedi klónok affinitását immunoesszével ellenőrizzük. Az alkalmazott technika az indirekt ELISA. A target fehérjét hordozón immobilizáljuk, blokkoljuk, felvisszük az egyedi fág klónokat, majd az M13 fág pVIII-as burokfehérje elleni antitest-HRP (horseradish peroxidase) konjugátum segítségével detektáljuk a jelet. Szekvenálás Az ELISA pozitív klónokat szekvenáljuk. Munkánk célja az volt, hogy olyan módszert állítsunk be és validáljunk, amelynek segítségével ismeretlen specificitású antitestek által felismert epitópokat tudunk azonosítani. Tervünk, hogy ezzel a technikával az OBEKON projekt keretében a Biosystems International Kft. által létrehozott monoklonális antitesteket vizsgálunk, amelyek a kóros elhízás kialakulásában szerepet játszó illetve azt jelző fehérjéket ismernek fel. Az epitóp térképezés beállításához a fág display módszert használtuk. Kísérleteink során 12 aminosav hosszúságú random peptidkönyvtárat megjelenítő bakteriofággal dolgoztunk. In vitro szelekciót hajtottunk végre, amely során a vizsgált antitesthez kötődő fágokat választottuk ki majd szaporítottuk. A szelekciót követően ELISA teszttel ellenőriztük a kiválasztott fág klónok által megjelenített peptidek kötődését az antitesthez. Az ELISA által pozitívnak talált klónok DNS-ének szekvenálásával meghatároztuk a megjelenített peptid szekvenciáját. Az így kapott szekvenciák ismeretében lehetőségünk nyílik annak a peptidmotívumnak a meghatározására, amelyet a vizsgált antitest felismer. A pozitív ELISA jelet adó klónok szekvenciájának vizsgálata A sztreptavidin esetében a klónok tartalmazták a fehérje által felismert HPQ (His-Pro-Glu) szekvenciát (3). Ez az eredmény megmutatta, hogy a display rendszer megfelelően működik. Az αhSA-mAb esetében a klónok egy világos konszenszus szekvenciát tartalmaznak (4. ábra). Ennek a szekvenciának az albuminéval való összehasonlítása arra mutatott, hogy nem lineáris, hanem valószínűleg konformációs epitópot ismer fel a vizsgált antitest. A kapott motívum egyes részletei az albuminban szekvenciálisan is megtalálhatók (5. és 6. ábra), azonban ezek a szekvenciák önmagukban nem voltak alkalmasak arra, hogy egy fehérje adatbázisban végzett keresés (BLAST keresés) alapján egyértelműen azonosítani tudjuk a humán szérum albumint. Munkánk során igazoltuk, hogy a fág display módszer működik antitestek epitóp térképezésére és validáltuk azt egy kontroll fehérje (sztreptavidin) illetve egy ismert specificitású antitest (αhSA-mAb) segítségével. A szelekció végrehajtása A módszer validálásához két kísérletet végeztünk el. Az elsőben a vizsgált target a sztreptavidin fehérje volt, a másodikban egy ismert specificitású antitesttel, az αhSA-mAb-tel (humán szérum albumin elleni antitest, BioSystems International Kft.) végeztük el a szelekciót. Mindkét kísérletben 10 µg target fehérjét használtunk a szelekciós körök során. Mind a sztreptavidin, mind az αhSA-mAb esetében végeztünk negatív kontroll kísérletet, amelyben nem immobilizáltunk target fehérjét (antitestet) a mikrotiter tálcán. Minden szelekciós kör után meghatároztuk az eluált fágok mennyiségét, amelyek a szelekció előrehaladtával dúsultak a negatív kontrollhoz képest (1. ábra). A második és harmadik szelekciós kör után egyedi klónt izoláltunk, amelyekkel ELISA tesztet végeztünk. A második kör után a klónok egy része már erősen kötődött az ELISA teszt alapján (2. ábra), a harmadik kör után pedig a sztreptavidin esetében az összes klón ELISA pozitív volt, az αhSA-mAb esetében 12 klónból 11 erősen kötődött (3. ábra). Az ELISA pozitív klónoknak meghatároztuk a szekvenciáját (4. ábra). 2. ábra - ELISA teszt a 2. szelekciós kör után Az ábrán az αhSA-mAb második szelekciós kör után izolált 12 egyedi klón ELISA tesztje látható. Ezek nagy része már erősen kötődik a targethez. 3. ábra - ELISA teszt a 3. szelekciós kör után Az ábrán az αhSA-mAb harmadik szelekciós kör után izolált 12 klón ELISA tesztje látható. A 12. klón egy keverék, ez a harmadik kör eluátuma, amely pozitív kontrollnak tekinthető. A többi, 11 egyedi klónból 10 a pozitív kontrollhoz hasonló méretű jelet ad, ezeknek határoztuk meg a szekvenciáját. 1. ábra - Dúsulás a szelekció során Az ábrán a szelekciós körök után (az eluátumokból) meghatározott fágtitert ábrázoltuk. Ez láthatóan növekszik a szelekcióval, a harmadik kör után egy nagyságrend az eltérés a kontrollhoz képest. 4. ábra - Az ELISA pozitív klónok aminosav szekvenciái Az ábrán látható az ELISA pozitív 10 egyedi klón. A 12. minta keverék, ami a harmadik szelekciós kör eluátuma, ez tulajdonképpen egy lehetséges konszenzus szekvencia. Az X bármilyen aminosav lehet; a színekkel jelölt aminosavak az 5. és 6 ábrán is azonos színekkel jelölt aminosavaknak feleltethetők meg. 5. ábra - A humán szérum albumin szekvencia részlete Valószínű, hogy az ábrán a (Asp-Leu-Pro-Ser-Leu- Ala), 313 (Lys) és 376 (His) kiemelt aminosavak a fág display segítségével kapott szekvenciákban (4. ábra) az azonos színnel jelölt aminosavak feleltethetők meg a térszerkezet (6. ábra), illetve a szekvencia összerendezés alapján. 6. ábra - A humán szérum albumin térszerkezete Az ábrán a humán szérum albumin térszerkezete látható (Pymol programmal megjelenítve). Az ábra jobb oldalán látható, színekkel kiemelt aminosavak a 4. és 5. ábrán azonos színekkel kiemelt aminosavaknak feleltethetők meg. Valószínűleg ez a fehérje antigénként szolgáló felszíne, amit az antitest felismer. 1. Cortese et al.: Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Curr Opin Biotechnol Scott et al.: Searching for peptide ligands with an epitope library. Science Devlin et al.: Random peptide libraries: a source of specific protein binding molecules. Science 1990