A protein S hiány diagnosztikájának nehézségei Bereczky Zs, Tisza B, Muszbek L Debreceni Egyetem, Orvos és Egészségtudományi Centrum Klinikai Kutató Központ

A Protein S biokémiája 1977, DiScipio, Seattle K-vitamin függő egyláncú glikoprotein, 70 kDa Szintézis helye: máj, endothel, megakaryocyták Megtalálható: plazmában, endothel felszínén, thrombocyta alfa granulumokban, Koncentrációja a plazmában: 10 mg/L, Féléletidő: 42.5 óra Trombin-szenzitív régió (E4): Cys47-72 loop EGF-domének 1-4 (E5-8): Ca2+-kötés, Kofaktor funkció SHBG-domén (E9-15) Szignál szekvencia, pre-és propeptid (E1-2) Gla-domén (E2): 11 glutamáton, Ca2+-kötés, PL-kapcsolódás Hidrofób régió (E3)

A plazmában csak 40% található meg szabad formában, 60% nem kovalens C4bBP komplexben van. Alfa láncok Béta lánc C4bBP: akut fázis fehérje, -láncán kötődik PS-hez 1:1 arányú komplexet képeznek A kapcsolódásban a PS SHBG doménje (Gly605-Ile614) vesz részt. Csak a szabad forma antikoaguláns hatású

A Protein S funkciója 1. Kofaktor az APC mellett PL felszínen 2-25x-re fokozza a FVa és FVIIIa bontást 2. Direkt inhibitor hatás A protrombináz és a tenáz komplexet is gátolja, FVa-hoz és FXa-hoz képes kapcsolódni A C4bBP-kötés csak az APC függő FVa inaktiváló hatást akadályozza, az APC-független hatások megmaradnak Koppelman, 1995, van de Poel, 2001

A protein C-protein S rendszer szabályozása PS-PCa komplex Trombomodulin + Trombin PCI Protein S PS-C4bBP komplex Protein C Protein Ca-PCI Protein Ca C4bBP Trombin

Protein S gének (3p11.1-3q11.2) PROS1: 80kb 15 exon, 14 intron ez az aktív gén PROS2: pseudogén exon homológia: 97% Exon 1 nincs inszerciók, deléciók, frameshiftek

Protein S deficiencia Öröklésmenet: AD Gyakoriság: 1:16,000 A thrombophilia oka: 3-5% 1984, Comp et al. Plazma szint 30%-65% totál heterozigótákban: 15%-50% szabad A heterozigóták tünetei: DVT (szokatlan lokal.), PE, Sync. necr. arteriás thrombosisok thrombophlebitis Homozigóták: < 5%, DVT, PE neonatalis purpura fulminans

Protein S hiány típusai I. Normál PS molekula csökkent szintézise csökkent szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás II. Kóros PS molekula normál szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás

Protein S meghatározás lehetőségei I. Antigén meghatározás 1. Totál PS (ELISA, immunturbidimetria) 2. Szabad PS (ELISA, ligand-kötő assay, immunturbidimetria) II. Funkcionális teszt - szabad PS

Szabad protein S antigén meghatározás 1/ Két dimenziós immunelektroforézis 2/ C4bBP-PS komplex eltávolítása PEG precipitációval, a felülúszóban maradó szabad PS meghatározása ELISA-val 3/ Csak a szabad PS-t felismerő két monoklonális antitest segítségével egy lépéses szendvics ELISA 4/ Ligand kötő assay ELISA lemezhez kötött C4bBP-t használnak a szabad PS megkötésére 5/ Latex-érzékenyített immunoturbidimetriás meghatározás, a szabad formát felismerő antitestpárral (Stago), vagy C4bBP+antiPS antitesttel (IL)

1. Immunoturbidimetriás meghatározás monoklonális anti-PS antitestpárral + + 2. Immunoturbidimetriás meghatározás C4bBP és monoklonális anti-PS antitest felhasználásával + +

A szabad protein S antigén meghatározás néhány gyakorlati kérdése Leggyakrabban alkalmazott eljárások: ECAT NEQAS ELISA 37% 25% Immunturbidimetria 59% 75% Szabad protein S antigén koncentráció kifejezése: totál PS százalékában (elavult), vagy normál poolozott plazma szabad PS tartalmára közvetlenül kalibrálva

Protein S funkcionális teszt- APC kofaktor funkció Beteg plazma hígítás Referencia/Kontroll plazma hígítás Protein S deficiens plazma APTI reagens (PL + aktivátor)-FXa/Tromboplasztin (PI)/RVV (Faktor Va) Aktivált Protein C 240 sec inkubáció 37oC-on 25 mM CaCl2 Az alvadási idő megnyúlás mértéke egyenesen arányos a vizsgálandó minta protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás értékekké konvertálhatók.

A protein S deficiencia diagnosztikáját nehezítő tényezők Analitikai (metodikai), preanalitikai problémák: “PS deficiencia” a kémcsőben PS szintet befolyásoló tényezők: PS csökkenés valódi deficiencia nélkül Szerzett PS deficienciák Öröklött PS deficienciák: a genetikai diagnosztika problémái

(optikai koagulométerek) Kalibrátorok, aktivátorok A PS funkcionális teszt eredményét befolyásoló tényezők Bi, lipid, Hgb (optikai koagulométerek) Kalibrátorok, aktivátorok Vérvételi cső Heparin, LMWH, heparinoidok APC rezisztencia Lupus anticoagulans Emelkedett FVIII A PS antigén meghatározást befolyásoló tényezők Reuma faktor, heterofil antitestek Inkubációs idő, hőmérséklet

Protein S meghatározását befolyásoló tényezők Eltérő reagenskészletek szignifikánsan eltérő eredményeket adhatnak (kalibrációs plazmák, aktivátorok) Pl.: A és B reagens median: 49, 42% C és D reagens median: 64, 74%- p<0.001 (ECAT 2007) Jennings et al. JTH 2003; 1:1112-4 Bár mindhárom értékelt kit jelezte a PS deficienciát, a PS aktivitás értékek különböztek: 44.5, 27.7, 24.5%

2. Vérvételi cső: Kratz et al. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:39-44. A műanyag csőbe levett minta PS aktivitása szignifikánsan csökkent az üvegcsőhöz viszonyítva, de ez klinikailag nem okozott problémát üveg cső PS: 99.8 (30.2)%műanyag cső PS:94.3 (27.3)% 3. Emelkedett FVIII szint alámérést okozhat: általában 250% felett okoz problémát (PI alapú tesztnél FVII!) Hőmérséklet (szabad PS antigén meghatározás): Dahlback, Thromb Haemost 2001;86:1144-7. A PS deficiens betegek hígított plazmájában a 37°C-on mért szPS ag 2x-ese a szobahőn kapott értéknek, ennek oka a PS-C4bBP hőmérséklet függő disszociációja.

Leiden mutáció esetén a PS deficiencia II. típusának megítélése bizonytalan: Faioni et al. Thromb Haemost 1993;70:1067-71. Jennings et al. JTH 2003;1:1112-4. 3 különböző funkcionális tesztben alámérést okozott a FVLeiden mutáció Deitcher et al. Thromb Res 2003; 112:349-53.

6. Lupus anticoagulans jelenléte befolyásolhatja a funkcionális tesztet: Rossi et al. Thromb Res 1992;65:253-62. PS aktivitás (%) szPS antigén (%) LA+betegek (n=16) 65  23 88  17 LA-betegek (n=17) 87  15 93  17 P 0.02 NS Moraes et al. Pathology 2000;32:94-7. Az LA+ és - betegek PS értékei között nem talált különbséget.

Alkalmas-e a funkcionális protein S teszt önmagában a PS deficiencia szűrésére? Rodger et al. Pathophysiol Thromb Haemost 2004;33:202-5. A funkcionális teszt szenzitivitása: 45.5%, specificitása: 95.3%, Neg. prediktív érték: 88.6%, Poz. prediktív érték: 68.5% PS deficiencia aluldiagnosztizált ha csak az aktivitás mérésére hagyatkozunk

A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás) tényezők nem, életkor, hormonális státusz, hormonpótlás, oralis anticoncipiensek (a C4bBP is), terhesség (2. trimeszterben akár 45% alá is csökkenhet) életkor 1 nap FT PT 1 hó 6 hó felnőtt 36 (24-48) 26 (14-38) 63 (48-78) 56 (22-90) 87 (71-103) 82 (44-120) 92 (60-124) PS szint (%) Andrew, 1987, 1988, 1992 FT: érett úsz., PT: koraszülött

Valódi PS csökkenés SLE MM, tu. Kumarin terápia, K-vitamin def. májbetegség Öröklött PS deficiencia DIC, Akut thrombosis APS Varicella, HIV Nephrosis C4bBP> PS:Ag Gyulladás C4bBP

Öröklött PS deficiencia genetikai diagnosztikája A genetikai defektus jelenlétével legjobban a szPS antigén korrelál (II. típus nagyon ritka) Problémák: nagy gén, ezért a diagnosztika időigényes, pszeudo-gén miatt a PCR primerek tervezése nehézkes, a deficiencia hátterében nem mindig található meg a mutáció (intragén polimorf markerekkel, Southern blottal nagyobb gén defektusok azonosítása) Eddig több mint 150 különböző mutációt írtak le PROS1 adatbázis Polimorfizmusok: Pro626 CCA-CCG, intronK C54T, alternatív poliA szekvenciák, Ser460Pro: PS Heerlen- fokozott affinitás C4bBP-hez

Protein S gén-exon 9 A B

Protein S mutációs adatbázis www.isth.org Mutáció típusa Előfordulási gyakoriság Nukleotid szubsztitúció 80% Misszensz mutáció 60% Nonszensz mutáció 23% Splice site mutáció 17% Inszerciók/deléciók 20% Nagy deléciók <1% Homozigóta vagy összetett heterozigóta: az esetek 3%-a II. típusú deficiencia: az esetek 5%-a

De Frutos et al. Thromb Haemost 2007;98:543-556.

A mutáció a Gla domén és a trombin szenzitív régió között Beteg PS aktivitás (%) PS szabad antigén (%) FV Leiden Egyéb PS genetikai vizsgálat FI 54 60 vad típus - Pro42Thr heterozigóta FJ 41 53 KM 61 71 heterozigóta Mutáció nem detektálható LMK 46 75 emelkedett FVIII SBB 51 58 LA+ Exon 3: Pro42Thr Pro626 Lys177 A mutáció a Gla domén és a trombin szenzitív régió között egy kis amfipatikus helixben helyezkedik el.