Bakteriális kemotaxis Kurzusvezető: Dr. Kőhidai László 2012.

A kemotaxis során megfigyelhető eltérő mozgási formák értelmezése

{ A baktérium ostor - 12-30nm 5 monotrich lopotrich peritrich Felépítő protein: flagellin (53.000) pentahelikális felépítés gyors regeneráció (3-6 perc)

A baktérium ostor bazális testének szerkezete { ostor 22.5 nm „hook” { L rotor P 27 nm S M stator

CCW CW A baktérium ostor rotációjának iránya és a mozgás-típusok közötti összefüggés CCW CW tumbling

R M Berry: Torque and switching in the bacterial flagellar motor. An electrostatic model. Biophys J. 1993 April; 64(4): 961–973

Gradiens Gradiens Egyenes szakaszok hossza Tumbling szám

E. COLI

E. COLI

! A bakteriális kemotaxis és adaptáció A sejtek mozgására nem csupán a koncentráció-grádiens változása hat ! Az adaptációs mechanizmusok megléte e sejtek „primitív” memóriájának létélre utal.

cukrok dipeptidek aminosavak periplazmikus kötő/szállító molekulák kemotaxis receptporok intracellulláris szignalizációs út

Bakteriális cheotaxis receptorok kimutatása osztódási gyűrű receptor

Aszpartát receptor ligandkötő-hely „coiled-coil” domain metilációs helyek szignáltovábbító rész

szignál továbbító rész Asp receptor részei ligandkötő hely C O C O metilációs hely 8 db szignál továbbító rész alap-aktivitásban

Asp kemotaxis receptor metilációja metiltranszferáz C O C O CH3 CH3 metilészteráz

Repellens molekula CheW , CheB-P CheA CheA-P CheA-P + CheY 200 ms CheA CheA-P CheA-P + CheY CheY-P+ CheA Mg2+ CW rotáció „tumbling” CheY-P + CheZ CheY + Pi Mg2+

Attraktáns molekula CheA aktivitás CheY-P mennyiség H+ vándorlási iránya az ostor motor régiójában megfordul CCW rotáció „úszás”

Trg Tsr Tar Tap CheR CheB-P CheA CheW CheZ CheB CheA-P CheY MOTOR galaktóz ribóz Ni2+, Asp Leu, Ser dipeptidek Tap Trg Tsr Tar CheR CheB-P CheA CheW CheZ CheB CheA-P CheY MOTOR CheY-P

CheA CheW CheR CheB CheY CheZ Ser Asp Maltóz Ribóz D-Gal Dipeptid Tsr Tar Trg Tap Aer CheA CheW CheR CheB CheY CheZ MotA =MotB Ser -m Asp +P Maltóz FliG FliM FliN MalE +P Ribóz RbsB -P D-Gal MglB Dipeptid DppA +m Gázok m = metiláció P = foszforiláció

Repellens molekulák Receptor Effektor CH3 CheA CheY-P CheB-P Che A-P

L CheD H2O NH3 -CH3 CheR SAM Homocyst CheW CheV -P CheB H2O Methanol -P ATP ADP CheA CheY CheZ Pi Pi Sink P- CheY P- CheC CheX FliY Motor app

A CheY szerkezete

A ChA - ChY komplex

Baktérium legfontosabb flagelláris proteinjei FlgK - a „hook” régió FlgD- hosszát szabályozza FlgB, C, G - összekötő „pálca” FliF - M-gyűrű Mot A - Transzmembrán proton-csatorna Mot B - Kapcsoló fehérje Fli G - CheY-CheZ Fli M- kapcsolat Fli N-

Flagelláris proteinek Több operonon elhelyezkedő, 30-nál több gén határozza meg Szintézisét, illetve expresszióját a Sigma 28 faktor szabályozza „Hook asszociált protein” (HAP) : - a flagellin molekulák nukleációs helyét adja - növeli a mechanikai ellenállóképességet Fő fajtái: Fli, Flg, Flh

A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése CheA - hisztidin autokináz P1 - 22 aminosav, nem gátlódó régió P2 - 25 aminosav, a CheY interakcióban vesz részt CheAL (long) - His48 autofoszforilálódik, mely része a CheY és CheB aktiválódási folyamatának CheAL működése pH-függő. Optimális pH 8.1 - 8.9 - ha a citopl. pH 7.6 alá csökken a Tar és Trg receptorok továbbítanak szignált ChAS (short) - kináz aktivitással rendelkező, de NEM autofoszforilálódó alegység - aminoterminálisan 97 as. szekvencia hiányzik

A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése CheA hyper kináz - pontmutáció a Pro337-nél, melynek következménye a foszforiláció sebességének növekedése A CheA a CheV foszforilációját is irányitja CheN - Bacillis substilisban található és homológ E. coli CheA-jával

A bakteriális kemotaxis proteinek jellemzése CheY - 128 as.-ból áll, foszforilációját a konformáció megváltozása követi számos pozícióban lévő as. helyzete változik, pl.: 17, 21, 23, 39, 60, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 85, 86, 87, 88, 94, 107, 109, 112, 113, 114, 121 A Mg2+ jelenléte a CheY aktiválódásához elengedhetetlen Mg2+ hatására a Lys109 - Asp 57 közötti sókötés felszakad, ez lehetővé teszi a molekula foszforilációját

Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése MCP1 - Tsr, MCP2 - Tar, MCP3 - Trg, MCP4 - Tap H1 - 97 kD pI 5.1; H2 - 86 kD pI 5.1; H3 - 76 kD pI 5.3 DcrA - Hem tartalmú, 668 as.-ból álló, 2 hidrofób szekvenciát tartalmazó oxigén szenzor, mely a redox-potenciál változásaira reagál (Desulfovibrio vulgaris) Tlpc - 30% homológiát mutat az E.coli MCP-jével; defgektusa esetén elmarad a pathológiás kemotaxis

Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése A metiláció táplálékmolekula-függő folyamat (pl. E.coli) Éheztetés hatására egy 43kD-os, membrán-asszociált protein metilációja figyelhető meg; - táplálék molekulák jelenlétében a metiláció leáll A metilációs rendszer és a kemotaxis aktivációja közötti kapcsolat a kemotaxis receptorok, illetve szignalizációs folyamat alapvető evolúciós hátterére utal

Metil-Accepting Chemotaxis proteinek (MCP-k) jellemzése MCP-k demetilálódása -CH3 Attraktáns MCP-CH3 CARRIER -CH3 gyors CARRIER -CH3 Metanol + CARRIER lassú A nem metilált intermedier „tumblingot” idéz elő, majd kialakul az ADAPTÁCIÓ

MCP-fluoreszcencia kimutatása eltérő fenotípusú sejtekben

Adaptáció - Tumbling

A sejtek elhelyezkedése optimális koncentrációt Jelentő gyűrűkben - adaptáció Ser gyűrű Asp gyűrű

Metiláció – Szénhidrát típusú ligandok hatása

Metiláció - időfüggés

Metil-transzferázok CheR Kemotaxis - Evolúció Metil-transzferázok CheR Homológia: E.coli metil-transzferáza metilálja a Bac. subst. MCP-jét Eltérés: Bac. subst. CheRB Adaptáció repellensekhez E.coli CheRE Adaptáció attraktánsokhoz

Metil-észterázok CheB Kemotaxis - Evolúció Metil-észterázok CheB Homológia: Bac.subst. MCP E.coli CheB + ATTRAKTÁNS DEMETILÁCIÓ Bac.subst. CheB E.coli MCP DEMETILÁCIÓ + ATTRAKTÁNS A reakciók sebességét az MCP határozza meg

Metil-transzferázok CheR Kemotaxis - Evolúció Metil-transzferázok CheR Homológia: E.coli metil-transzferáza metilálja a Bac. subst. MCP-jét Eltérés: Bac. subst. CheRB Adaptáció repellensekhez E.coli CheRE Adaptáció attraktánsokhoz

E. coli B. subst. C. gelida Methanol-képződés dinamizmusa és a ligandspecifitás

Kemotaxis - Evolúció Bac.subst. CheY E.coli CheA CheY-P Bac.subst. CheY-P E.coli CheZ CheY-P CheY Bac.subst. pozitív kemotaxis a esetén - CheY-P E.coli pozitív kemotaxisa esetén - Chey-P Bac.subst. és E. coli CheW 28.6% homológia Bac. subst. CheB és E.coli CheY 36% homológia Bac. subst. és E. coli - M gyűrű és pálca

Ca2+ hatása baktériumok kemotaxisára Kimutatható egy 38kD-os Ca2+-kötő fehérje Ca2+ csatorna gáltók (pl. verapamil, LaCl3) a kemotaxis zavarát okozzák

Che A (kb. 650 AS) Che Y (kb. 120 AS) P1 P2 P3 P4 P5 N H C Foszforiláció RR-bdg. Dimer Katalít. CheW rec bdg. Che Y (kb. 120 AS) N DD D T/S K C Mg2+ bdg. Foszforiláció Katalít.

Sigma faktor Che ? Sigma28 Bas.test CheW CheY CheB A Sigma28 faktort kódoló gén egy 26 kb-os operon része A flagellin, a „hook-asszociált protein” (HAP) és egyes motor proteinek szintézisét szabályozó régió Hiánya: paralizált flagellum; MCP hiány

Bakteriális chemotaxis mérése 3-csatornás rendszerben