IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László

AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló szekvenciák mutagenezise 1, deléciók 2, inzerciók 3, szubsztitúciók 4, pont mutációk 5, hely specifikus mutációk (v. site-directed mutagenesis v. oligonukleotid-irányította mutagenezes) 6, random-mutagenezis

DELÉCIÓK I. Fragmentum kivágása restrikciós endonukleázzal. DNS EcoRI EcoRI ligálás mutált DNS

DELÉCIÓK II. Deléciók készítése BAL 31 exonukleázzal: BAL 31 exonukleáz tulajdonságai: 1, 3’ 5’ exonukleáz aktivitás: mononukleotidok eltávolítása dupla szálú DNS-ről 2, 5’ 3’ exonukleáz aktivitás: mononukleotidok eltávolítása egy- 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ exonukleáz aktivitás 5’ 3’ 3’ 5’

EMÉSZTÉS BAL 31 EXONUKLEÁZZAL

Klasszikus site-directed mutagenezis elve mutációt hordozó oligonukleotid egyszálú DNS DNS polimeráz megszintetizálja a komplementer láncot az oligonukleotid, mint primer felhasználásával ligálás + bakteriális transzformáció mutáns plazmid vad plazmid

Klasszikus site-directed mutagenezis lépései 1, Oligonukleotid tervezése és szintézise 2, Oligonukleotid hibridizációja az egyszálú DNS plazmidhoz 3, A komplementer DNS lánc szintézise az oligonukleotid primer és DNS polimeráz felhasználásával a 4 dNTP felhasználásával 4, Az új DNS lánc „körösítése” DNS ligáz segítségével 5, Kompetens baktériumok transzfekciója 6, A mutáns plazmidot hordozó baktérium-telepek azonosítása 7, A mutáns DNS izolálása a baktériumokból (miniprep) 8, A mutáns DNS megerősítése DNS szekvenálás segítségével

PCR ALAPÚ MUTAGENEZIS Egyszerű esetben: 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ mutáns primer 3’ 5’ 3’ 5’ primer 3’ 5’ 3’ 5’ mutáns PCR termék

Bonyolultabb esetben: primer II. 3’ 5’ 3’ 5’ primer I. Ide szeretnénk mutációt betenni Mit lehet tenni?

3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ MEGOLDÁS: MEGPRIMER MÓDSZER primer III. I. PCR reakció Hibridizáltatjuk az eredeti DNS-t az új PCR termékekkel 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’

3’ 5’ 3’ 3’ 5’ megaprimer primer III. II. PCR reakció végleges mutáns PCR termék

„ADD-ON” MUTAGENEZIS 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ primer II. primer I. primer IV. primer II. 5’ 3’ 3’ 5’ primer I. primer III.

5’ 3’ 5’ 3’ PCR-A PCR-B 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ primer IV. primer II. primer III. PCR-A PCR-B 5’ 3’ 3’ 5’ PCR termékek denaturációja, majd összekeverése 5’ 3’ 3’ 5’

5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ végek extenziója vagy 5’ 3’ 3’ 5’ 3. PCR reakció primer I és II-vel primer II. 5’ 3’ 3’ 5’ primer I.

TETSZŐLEGES GÉNSZAKASZ AMPLIFIKÁCIÓJA PCR SEGÍTSÉGÉVEL 5’ 3’ DNS 3’ 5’ Ezt a génszakaszt szeretnénk amplifikálni és utána egy adott vektorba ligálni. Milyen primereket tervezzünk? primer II. 5’ 3’ ? 3’ 5’ primer I.

Resrtrikciós enzim hasítási helyeket kell elhelyezni a primerekben. pl. BamH1 5’ 3’ 3’ 5’ pl. EcoRI PCR reakció BamH1 EcoRI PCR termék a tervezett restrikciós enzim hasítási helyekkel

A tervezett primerek 5’ végének egyáltalán nem kell illeszkedni a komplementer DNS szálhoz BamH1 5’ 3’ 5’ EcoRI PCR reakció lehet epitop-cimkét kódoló DNS szakasz PCR termék, mely tartalmaz egy epitop-cimkét és két restrikciós endonukleáz hasítási helyet.

„UNIQUE SITE ELIMINATION” MÓDSZER (Amesrham-Pharmacia)

„QUICKCHANGE” MÓDSZER (Stratagene)

„GeneEditor” MÓDSZER (Promega)

RANDOM MUTAGENEZIS FORMÁI 1, Kémiai mutagenezis 2, „Kazetta” mutagenezis 3, „Misinkorporációs” mutagenezis

-- a random mutagenezis legjobb hatásfokú fajtája KÉMIAI MUTAGENEZIS -- a random mutagenezis legjobb hatásfokú fajtája -- általában max. 200 bp mutagenezisére használják -- kémiai mutagénekkel kezelik a dupla szálú DNS-t, ilyenek: hidroxilamin, salétromossav, biszulfit, hidrazin, hangyasav, kálium-permanganát pl. hidroxilamin dezaminálja a citozint uracil keletkezik biszulfit dezaminálja a citozint uracil keletkezik hidrazin elhasítja a citozin és timin heterociklusos gyűrűit, ami végül a pirimidin nukleotidok elvesztéséhez vezet. A DNS replikáció során az „ilyen” nukleotiddal szemben bármelyik 4 nukleotid beépülhet -- sajnos a kémiai mutagenezis hatásfoka nagyon alacsony

„MISINKORPORÁCIÓS” MUTAGENEZIS -- in vitro DNS szintézisnél a 4 nukleotid közül az egyikből nagyon keveset teszünk a reakcióelegybe -- az „éhező” DNS polimeráz ezért a másik három nukleotidból fog beépíteni a hiányzó helyére -- a DNS polimeráznak rossz vagy hiányos hibajavító képességűnek kell lennie, pl. Klenow-fragment vagy Taq polimeráz