Glutation és a kapcsolódó mechanizmusok Fitokelatinok, metallotioneinek

A nehézfémfelesleg hatásai Más elemek gyökér általi felvételének befolyásolása (Cd, Cu, Zn) Szabad oxigéngyökök generálása Cu+ + O2 → Cu2+ + O2.- Cu+ +H2O2 → Cu2+ + OH- + OH. lipidperoxidáció iniciálása Cu+ + LOOH → Cu2+ + OH- + LO. Cu2+ + LOOH → Cu+ + H+ + LOO. Enzimek működésének gátlása (pl. NR-t az Pb) Klorofill bioszintézis gátlása (δ-aminolevulinsav DH, protoklorofillid reduktáz)

A nehézfémfelesleg hatásai A nehézfém-toxicitás általános tünetei gyökér- (hajtás-) növekedésének gátlása vízfelvétel- és belső vízmozgás gátlása Különösen magasabb koncentrációban a legtöbb nehézfém: gátolja sztómák nyitódását és a transzspirációt CO2-fixáció, a fotoszintézis egyes folyamatainak gátlása károsítja a plazmamembránt

A nehézfémrezisztencia lehetséges mechanizmusai Elkerülés (baktériumban P-típusú ATPázok kipumpálják) Detoxifikálás a sejten belül (kelatálás, transzport) - fehérjék indukciója hősokk (Heat-shock) proteinek, metallotioneinek, fitokelatinok, ferritin, transzferrin - antioxidáns enzimek indukciója és aktiválása szuperoxid dizmutáz, kataláz, glutation peroxidáz - szerves savak magasabb „turnover”-e malát, citrát, oxalát, fitát, szukcinát stb. A nehézfémtolerancia fontos a nehézfém hiperakkumuláláshoz !

A Cd kelatálásában és vakuólumba juttatásában központi szerepe van a glutationnak

Antioxidáns védő mechanizmusok

Az aszkorbinsav-glutation ciklus szerepe a H2O2 eltávolítása

A glutation

A glutation szerepe a növényekben Előfordulása: kloroplasztiszban,citoszólban, mitokondriumban mM-os nagyságrendben (500 µM - 5 mM) Redukált/oxidált glutation aránya: normál körülmények között: 90-99 % stresszhatásra: 30-80%

Redukált glutation – oxidált glutation 2 GSH → GSSG Oxidált glutation = glutation diszulfid

A glutation szerepe a növényekben Oxidatív stressz elleni védelem (GR, GSPX) Szubsztrátja a glutation S-transzferáznak Redox puffer, redox szabályozás (fehérjék -SH csoportja, sejtciklus) Génexpresszió szabályozása Fitokelatinok prekurzora Fő raktározott formája a redukált kénnek A szervek közötti kénmegoszlás szabályozása

A glutation bioszintézise

A glutation szintetáz, GS (GSase) Transzgénikus nyárfa Citoszolban, 100-szoros GS-növekedés, GSH tartalom nem nőtt Transzgénikus Brassica j. : 2-3-szoros növekedés a Cd-toleranciában

g-glutamil cisztein szintetáz, g-ECS Szerepe bizonyított a GSH szint emelkedésben stresszhatásra Transzgénikus nyárfa: citoszolban: enzim mennyiségben 5-10-szeres növekedés, 2-3-szoros GSH- és GSSG- szint növekedés (a redox állapot nem különbözött a kontrolltól !) Kloroplasztiszban: hasonló eredmény Transzgénikus Brassica j. : 2-3-szoros növekedés a Cd-toleranciában Transzgénikus dohány: nekrózis, csökkent növekedés

A bioszintézis génjének túltermeltetésével a glutation mennyisége megemelhető növényekben

Glutation reduktáz, GR Transzgénikus nyárfa kloroplasztiszban: 1000-szeres GR-növekedés 2-szeres növekedés a glutationban (aszkorbát mennyisége is nőtt stresszhatásra) citoszolban:5-10- szeres GR növekedés glutation mennyisége nem nőtt GR overexpresszió a kloroplasztiszban növeli a GSH/GSSG arányt és a totál glutation mennyiséget is Transzgénikus dohány: 1-3,5-szörös GR növekedés

Glutation bioszintézis és homeosztázis összetett szabályozása

A glutation szintézise, felhasználása és lebontása a növényi sejtben GSH: redukált glutation, Glu: glutaminsav g-ECS: g-glutamil cisztein szintetáz, GSase: glutation szintetáz, GSSG: glutation diszulfid, GRase: glutation reduktáz, GST: glutation S-transzferáz, PCS: fitokelatin szintetáz, CPase: karboxipeptidáz, g-GTase: g-glutamil transzpeptidáz, DPase: dipeptidáz

A glutation S-transferáz (GST) szerepe Különböző elektrofil komponensek konjugálása GSH-val (endogén metabolitok, gyomirtószerek detoxifikálása ) GSH-PX funkció→ lipid peroxidok detoxifikálása GST/GS-PX gént túltermelő transzgénikus dohány növények megemelkedett stressz toleranciával rendelkeznek izomerizációs reakciók katalizátora (pl. aromás aminosavak lebontásában) nem-enzimatikus szállító (ligandin-funkció): endogén molekulák kötése nem-katalitikus helyen (kötés és transzport) - auxin- és citokinin-kötő fehérjék - cianidin-3-glukozid vakuolumba történő transzportja - intracelluláris hormon transzport? Apoptózis szabályozása - véd a letális hatástól („Bax-inhibitor GST”)

A fitokelatinok Fémkötő polipeptidek (γ-Glu-Cys)2-11-Gly a felesleges, toxikus fémionok megkötése, kizárása, elkülönítése

A fitokelatinok

A fitokelatin szintáz (PCS) Nehézfémek és tiolátjaik aktiválják (Cd2+, Zn2+ ,Cd.GS2, Zn.GS2) C-terminális részen Cys-csoportok fontosak az aktiválásban cad1 mutánsok (Arabidopsis, S. pombe) mutáció a PC szintázban - Cd2+ -ra, Cu2+-ra hiperszenzitívek - fitokelatin-deficiensek PCS-expresszáló transzgénikus sejtek Cd2+-toleranciája és -akkumulációja, nagyobb, mint a kontrollé (S. pombe, S. cerevisiae, dohány, Arabidopsis)

Cd2+ kapcsolódása két fitokelatin molekulával A fitokelatinok Cd2+ kapcsolódása két fitokelatin molekulával

A fitokelatinok

A fitokelatinok A Cd2+-ot jól toleráló sejtekben a Cd2+ min. 90%-a Cd-fitokelatin komplex formájában található A Cd-fitokelatin komplexek általában a növényi sejtek vakuólumában találhatóak Transzporterük: ABC-transzporter (HMT1: heavy metal tolerance factor 1)

A vakuólum a növényi sejtek 90%-át is kitöltheti

Fitokelatin-közvetített Cd-transzport és Cd-S komplexek kialakulásának modellje

A kén csökkenti a Cd toxicitását

A metallotioneinek Kis molekulasúlyú, ciszteinben gazdag fémkötő proteinek (8-14 kDa, 50-70 aminosav, >30% Cys) „fitokelatin aggregátumok” ? Fitokelatinokhoz hasonló szerep a fémek komplexálásában (nagyobb affinitás a Cu-hez) Antioxidáns funkciójuk is lehet (membránok védelme) Génexpressziójukat befolyásolják pl. nehézfémek (Cu, Zn, Cd), sebzés, öregedés, patogén fertőzés.

S. cerevisie metallotionein A metallotionein molekula szerkezete, kiemelve a Cys csoportok S atomjait (világosabb gömbök ) és a kötött Cu atomokat (sötétebb gömbök)

A metallotioneinek csoportosítása aminosav sorrend és összetétel alapján I. típus: 20 Cys-t tartalmaznak (6 Cys-X-Cys két fő doménban, köztük kb. 40 aminosav) II. típus: N- és C-terminális részen más, konzervált elrendezésben vannak az aminosavak (pl. Cys-Cys, Cys-Glu-Glu-Cys, MSCCGGNCGCS) tipikusan növényi MT III. típus: N-terminális részen csak 4 Cys, C-terminálison 6 enzimatikusan, nem transzlációsan szintetizálódnak! IV. típus: 3 Cys-gazdag domént tartalmaznak (5-6 Cys), köztük 10-15 aminosav)

Egy metallotionein feltételezett szerkezete Az N- ás C-terminális részen lévő Cd- (kék gömbök) kötő fém-centrumokat hosszabb fehérjelánc köti össze.

A metallotioneinek Génexpressziójuk különbözhet szövettől függően is: I. típus gyökérben jobban expresszálódik, mint hajtásban, II. típus ellenkezőleg III. típus expressziója magas levelekben és éretlen termésekben IV. típus fejlődő magvakban expresszálódik. Nyárfában 6 MT expresszióját vizsgálták, eltérő mintázat

A nehézfémrezisztencia lehetséges mechanizmusai Fémionok immobilizálása a sejtfalban (pektinek) PM permeabilitás változása, kompartmentizáció a vakuólumban Aktív kijuttatás Kelátképzés a citoplazmában, vakuoláris transzport

Lehetőségek a növények nehézfém rezisztenciájának, akkumulációjának, transzportjának növelésére