Készítette: Czermann Mónika OECD 215

A teszt célja Az OECD 215-ös számú irányelv célja, hogy értékelje a vizsgálandó vegyi anyag halivadékok növekedésére gyakorolt hosszú távú hatásait. 2 [1.]

A TESZT LEÍRÁSA 3 [2.]

Ajánlott halfajok a teszthez Az Európai Unión belül kifejlesztettek egy úgynevezett „gyűrűs tesztet” szivárványos pisztrángok ivadékaira (Oncorhynchus mykiss) átfolyásos rendszerben. 4 Szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss) A szivárványos pisztráng a leginkább javasolt faj erre a tesztre. [3.]

5 Más, jól dokumentált fajok is használhatók, de ekkor a vizsgálati eljárást esetlegesen módosítani kell, hogy a megfelelő feltételeket biztosítani tudjuk. Ilyen fajok; zebra dánió/zebrahal (Danio rerio) medaka (Oryzias latipes) Zebra dánió/zebrahal (Danio rerio) Medaka (Oryzias latipes) [5.][4.]

Halivadékok tartása A teszthez használt halegyedeket egyetlen állomány populációjából kell kiválasztani, lehetőleg ugyanabból az ívásból. A halivadékokat a teszt megkezdése előtt 2 hétig a tesztnél alkalmazott minőségű vízben és megvilágításban kell tartani. csak azt a populációt használhatjuk fel a teszthez, melynek halálozási arány kisebb, mint a populáció 5 %-a A vizsgálatot megelőző 2 hetes felkészítés során, illetve a vizsgálat teljes időtartama alatt a halivadékok nem kaphatnak semmiféle kezelést betegség esetén. 6

A vizsgálandó vegyi anyag tulajdonságai Ismerni kell a vizsgálandó vegyi anyag; vízoldhatóságát gőznyomását egy megbízható analitikai módszert a vegyi anyag mennyiségi meghatározásához Hasznos információk közé tartozik a vegyi anyag; szerkezeti képlete tisztasága stabilitása vízben és fényben disszociációs állandói (pK a, P ow ) biológiai bonthatósága 7 [6.]

Oldat készítése A megfelelő koncentrációjú oldatok a törzsoldat hígításával készülnek. Az oldat általában a tesztelt vegyi anyag hígító vízbe történő keverésével vagy rázásával állítható elő (pl. keverővel vagy ultrahangos berendezéssel). Oldószerek vagy diszpergálószerek alkalmazása is szükséges lehet bizonyos esetekben a megfelelő koncentrációjú oldat elkészítéséhez. megfelelő oldószer; aceton, etanol, metanol, dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, trietilénglikol megfelelő diszpergálószer; Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz (0,01%-os), HCO-40 8

Ügyelni kell a biológiailag gyorsan lebomló vegyszerekre (pl. aceton) és erősen illékony vegyületekre, mert ezek bakteriális felhalmozódási problémákat okozhatnak az átfolyásos vizsgálatoknál. Az alkalmazott diszpergálószer nem lehet hatással a halegyedek növekedésre és nem okozhat látható mellékhatásokat sem. 9 [7.]

Hígító víz minősége Minden olyan víz használható hígító víznek; mely biztosítja a vizsgált egyedek hosszú távú kényelmes túlélést a halivadékok növekedést mutatnak benne A vízminőségnek a vizsgálat alatt állandónak kell lennie. A hígító vízből meghatározott időközönként (pl. 3 havonta) mintát kell venni a következő komponensek ellenőrzésére; lebegő szilárd anyagok összes szerves szén peszticidek nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) főbb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO 4 ) 10 [8.]

Az elfogadható hígító víz néhány kémiai jellemzője a táblázatban látható; 11

Teszthez szükséges készülékek A következő készülékek szükségesek a teszt elvégzéséhez; oxigén és pH mérő keménység és lúgosság kimutatására alkalmas műszer megfelelő készülék a hőmérséklet-szabályozásához, és a folyamatos megfigyeléséhez kémiailag semleges anyagból készült tartályok (megfelelő kapacitással) analitikai mérleg 12 [9.] [10.]

A vizsgálat elve Tömegük lemérését követően az exponenciális növekedési fázisban levő halivadékok tartályba kerülnek. A halivadékok a vizsgálandó, vízben oldott vegyi anyag különböző koncentrációinak lesznek kitéve. Átfolyásos, vagy ha az nem lehetséges megfelelően beállított fél-statikus rendszert használjunk. átfolyásos rendszernél a víz és a vizsgálandó oldat folyamatosan cserélődik fél-statikus rendszernél nincs áramlás, a vizet és a vizsgált oldatot adott időközönként teljesen kicserélik (általában naponta) A vizsgálat időtartama minimum 28 nap. 13

A halegyedeket naponta etetik. A napi eleség mennyisége az egyes halegyedek kezdeti tömegétől függ a és 14. napot követően újraszámolható. A kísérlet végén a halegyedek tömegét ismét lemérik. 14 [11.] [12.]

A mérés végpontjának számítása A növekedési ütemre gyakorolt hatás egy regressziós modell segítségével elemezhető. ezáltal megbecsülhető az a koncentráció (ECx), mely egy x %-os eltérést okoz a fejlődési ütemben (ECx = hatásos koncentráció) pl. EC10, EC20, EC30, EC50 15 Az adatokat összehasonlítva a kontroll értékekkel meghatározható az a legnagyobb koncentráció, mely megfigyelhető hatást nem okoz (NOEC) és az a legkisebb koncentráció, mely már hatást okoz (LOEC). [13.]

A teszt érvényessége A teszt érvényességéhez a következő feltételeknek kell teljesülniük; a kontrollcsoport halálozási aránya nem haladhatja meg a 10%-ot a vizsgálat végén a kontrollcsoport halegyedeinek átlagos tömegét megfelelően meg kell növelni ahhoz, hogy a növekedési ütem minimális eltérését ki tudjuk mutatni a „gyűrűs teszt” során megállapították, hogy a szivárványos pisztrángoknál a kontrollcsoportok halegyedeinek átlagos tömege legalább a másfélszeresére kell nőjön az oldott oxigén koncentrációja legfeljebb a levegő telítettségi értékének 60%-a lehet a víz hőmérséklete legfeljebb ±1°C-al térhet el a kísérleti tartályok között 16

A TESZT ELVÉGZÉSÉNEK MENETE 17 [14.]

A halegyedek kiválasztása és tömegmérése 24 órával a teszt megkezdése előtt a halállomány etetését szüneteltetni kell. A halegyedeket véletlenszerűen kell kiválasztani. A halivadékokat óvatosan kell kezelni, elkerülve a stresszt okozó helyzeteket és sérüléseket. Egyszerű altatót használva megmérjük a halak nedves tömegét. egyszerű altató lehet pl. tricain-metán-szulfonát (MS 222) 100 mg/l-es vizes oldata szódabikarbónával semlegesítve (a semlegesítés aránya 2 egység szódabikarbóna egy egység MS 222-höz) 18

A halegyedek tömegének szórásának minimálisnak kell lennie. a középsúlytól (számtani középtől) mért ±10%-os tartományon belülre kell esnie 19 Azon halegyedek, melyek tömege beleesik az ajánlott tartományába (lásd a táblázatban), véletlen- szerűen szétosztjuk a vizsgálati tartályok között. Az egyes tartályokban a halegyedek összesített nedves tömegét fel kell jegyezni.

Állománysűrűség Az állománysűrűségnek megfelelőnek kell lennie a vizsgálathoz használt halegyedek számára. ha túl nagy, akkor a túlzsúfoltság miatt stressz léphet fel, mely a növekedési ráta visszaesését okozza, illetve betegségekhez vezet ha túl kicsi, az territoriális viselkedést eredményezhet, mely szintén befolyásolja a növekedést 20 [15.]

Etetés A halakat megfelelő mennyiségű és minőségű eleséggel kell táplálni, hogy elfogadható növekedési rátát érjünk el. A napi adag szétosztható két egyenlő részre, és legalább 5 órás különbséggel adagolható. 21 [16.]

Az adagokat minden tartály esetén a kezdeti össztömeg alapján ki lehet számítani. a halivadékok testtömegének 4%-a (de minimum 2 %-a) naponta Amennyiben a halegyedek tömegét a vizsgálat 14. napján újra lemérik, a napi eleség adag is újraszámolható. A tömegmérést megelőző 24 órában a halegyedek etetését fel kell függeszteni. Kerüljük el a mikrobák elszaporodását és víz zavarossá válását. 22 minden nap a tartályok aljáról el kell távolítani az el nem fogyasztott eleséget és ürüléket [17.]

Fény és hőmérséklet A megvilágítási időszakot, illetve a víz hőmérsékletét a vizsgált fajhoz kell igazítani. 23

Vizsgált koncentrációk A tesztelt vegyi anyag minimum 5 koncentrációját vizsgálni kell. a megfelelő koncentrációk kiválasztásában segítséget nyújthat a vizsgált anyag toxicitására vonatkozó előzetes adatok A legmagasabb vizsgált koncentráció nem haladhatja meg a tesztelt anyag oldhatósági határát. Amennyiben a törzsoldat előállításához diszpergálószerre 24 van szükség, a végső koncentrációja nem lehet magasabb 0,1 ml/l-nél, és lehetőleg minden vizsgálati tartály esetén azonos mértékű kell legyen. [18.]

Kontrollok száma A hígító víz kontrollok száma függ a vizsgálati oldattól (minimum 1 ). Ha diszpergálószert is használunk, akkor ugyanannyi diszpergálószeres kontrollra van szükség, mint ahány hígító vizes kontrollunk van. 25 a diszpergálószeres kontrollnak a diszpergálószert a legmagasabb vizsgált koncentrációval kell tartalmaznia [19.]

Analitikai ellenőrzések A tesztelés alatt, mind az átfolyásos, mind a fél-statikus vizsgálatok során a hígító és a mérgező törzsoldat áramlási sebességét naponta ellenőrizni kell. A vizsgálat teljes időtartama során az anyag- koncentrációk értéke nem változhat több mint 10 %-ot. ha az anyagkoncentrációk várhatóan a névleges értékek  20 %-ba esnek, a legnagyobb és legkisebb koncentrációkat kell kielemezni ahol a vizsgált anyag koncentrációja nem esik a névleges érték  20 %-os tartományába (pl. a vizsgált anyag stabilitási adatai alapján), az összes vizsgálati koncentrációt elemezni kell 26

A vízkémiai paraméterek közül az alábbiakat kell mérni; 27

Folyamatos vizsgálatok A halakat naponta meg kell vizsgálni a tesztelési időszakban és bármilyen külső rendellenesség (pl. vérzés, elszíneződés), vagy rendellenes magatartás feljegyzendő. 28 Az egyedpusztulásokat is fel kell jegyezni, majd a halegyedet a lehető leghamarabb el kell távolítani a tartályból. az elpusztult halegyedeket nem szabad pótolni az eleségmennyiséget a megváltozott helyzetnek megfelelően módosítani kell [ 20.]

A teszt befejezése A vizsgálatot követően ( 28. nap után) az összes életben maradt halegyedet lemérjük, mint nedves tömeget. egyenként, egymástól függetlenül Csoportokban is lemérhetjük őket a tartályok segítségével (ez a praktikusabb). 29 [ 22.] [ 21.]

Eredmények értékelése 30 [ 23.]

Növekedési ráta A növekedési rátát (r) többféleképpen lehet meghatározni attól függően, hogy a halegyedeket egyedenként mértük le vagy tartályokkal együtt csoportosan. Azon tartályok esetében, melyeknél a halálozási ráta magasabb, mint 10 %, a növekedési rátát nem szükséges kiszámolni. 31 Mindegyik vizsgálati koncentrációhoz fel kell tüntetni a halálozási rátát. [ 24.]

Eredmények értékelése regresszióanalízissel (koncentráció-hatás görbe) Összefüggést teremtünk a specifikus növekedési ráta és a koncentráció között, ezáltal lehetővé téve az ECx értékek becslését. Kiszámítjuk a tartályok átlagos specifikus növekedési rátáját (r 2 értékét). Ezzel a módszerrel számolhatunk kisebb méretű halfajok alkalmazása esetén is. 32 r 2 = tartály átlagos specifikus növekedési rátája w 1, w 2 = egy adott halegyed tömege t 1 és t 2 időpontokban t 1, t 2 = a vizsgálati időszak eleje és vége (nap)

A tartályok átlagos specifikus növekedési rátáját (r 2 értékeit) grafikusan ábrázoljuk a koncentrációk függvényében. így megkapjuk a koncentráció-hatás összefüggés görbéjét, melyről leolvashatóak az ECx értékek 33 [ 25.]

Eredmények értékelése varianciaanalízissel (ANOVA) Minden vizsgált koncentráció esetében párhuzamos méréseket kell indítani. Párhuzamos mérési sorozat esetén a NOEC és LOEC becslése a tartályok átlagos specifikus növekedési rátájának varianciaanalízisén alapszik (ANOVA). A koncentrációkra vonatkozó átlagos növekedési rátákat (r) összemérjük a kontroll tartályokra vonatkozó átlagos növekedési rátákkal ( 0,05 -ös szignifikancia szint mellett). 34

Ha a vizsgálat során nem indítunk párhuzamos méréseket, akkor a varianciaanalízis érzéketlenné válik. Ebben az esetben a varianciaanalízist a halegyedekre értelmezett „látszólagosan” specifikus növekedési rátákra (r 3 ) alapozzuk. Minden egyes koncentráció átlagos „látszólagosan” specifikus növekedési rátáját (r 3 ) a kontroll tartályok átlagos „látszólagosan” specifikus növekedési rátájával hasonlítjuk össze. 35 r 2 = „látszólagosan” specifikus specifikus növekedési rátája w 1, w 2 = egy adott halegyed tömege t 1 és t 2 időpontokban t 1, t 2 = a vizsgálati időszak eleje és vége (nap)

Felhasznált irodalom: OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS (215) - Fish Juvenile Growth Test 36

Képek forrása: [1.]: [2.]: [3.]: /showpage.cfm?surveynumber=241&usernumber=69 [4.]: [5.]: [6.]: [7.]: /focus_on_fish.html?ID=8272 [8.]: /egeszseges_ivoviz_lugos_alkalikus_ionizalt_viz/ [9.]: 37

[10.]: /index.php?1.1.1%20tanks%20used%20in%20Nagoya%20Univ. [11.]: [12.]: [13.]: /rocky-river-fishing-report-august-2010.html [14]: [15]: [16.]: [17.]: /images_library/details/37/rainbow_trout_aquarium_7/ [18.]: [19.]: /environmental-testing-to-the-test/ [20.]: 38

[21.]: [22]: /bile-isnt-vile-identifying-the-scent-that-lures-tr.shtml [23.]: [24.]: /slide3.htm 39