ATP (adenozin-trifoszfát) meghatározás a TCA (triklóracetát) extrakciós módszerrel

adenozin-trifoszfát az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik allosztérikus: az enzim nem csupán a szubsztrátkötésre alkalmas katalitikus hellyel rendelkezik, hanem még egy vagy több más, olyan hellyel is, ahol kicsiny, a szubsztráttól eltérő szerkezetű, szabályozó molekula, effektor vagy ligand megkötése válik lehetségessé (allosztéria = más alakú)  az ATP a legfontosabb molekula a sejtekben lejátszódó energia leadó és felvevő folyamatokban, az elhalt sejtekben az ATP gyorsan degradálódik → a mikrobiális aktivitás becslésére használható paraméter a talajból kivonható, majd mennyisége meghatározható

A meghatározásra alkalmazott módszerek legelterjedtebb: az ATP biolumineszcens reakciója segítségével (luciferin-luciferáz rendszer) gyors módszer nagyon érzékeny kimutatás HPLC módszerrel nem elterjedt sok időt vesz igénybe az analízis drága a szükséges felszerelés

Az ATP biolumineszcens reakciója A lumineszcencia olyan kémiai folyamat, ahol a molekula energia hatására gerjesztett állapotba kerül, majd alapállapotába visszajutva, fényt bocsát ki. az ATP a biokémiai reakció során luciferin-luciferáz enzimpreparátum hatására lebomlik, miközben biolumineszcencia (fénykibocsátás) történik az enzim reakcióba lép az élő szervezetek – mikrobák – energiataroló komponensével, az ATP-vel a reakció során oxiluciferin-luciferáz-AMP komplex képződik, amely oxidálódik a gerjesztett állapotban levő átmeneti komplex (*-gal jelölve) energiatöbbletét a normál állapotba visszatérve foton formájában adja le

A reakcióegyenletek A kibocsátott fény - műszeresen – luminométer segítségével detektálható minél erősebb a fényintenzitás, annál magasabb az ATP-tartalom, a mérés rendkívül érzékeny, hiszen 10-13 g ATP már kimutatható

Előnyök - hátrányok Előnyök: Hátrányok: rendkívül kis mennyiségű ATP jelenléte már nagy biztonsággal kimutatható rendkívül gyors vizsgálati módszer (a reakció 10 másodpercen belül lejátszódik) Hátrányok: az ATP extrakciós hatásfoka erősen függ a használt extraháló szertől az ATPáz és ATP kináz enzimek inaktivitásának sebességétől és intenzitásától az ATP adszorpciójától a talaj szerves és ásványi kolloidokon a talaj kivonatokban található különböző vegyületeknek (pl. NO3- Mg2+, Ca2+, Cl-) gátló hatása lehet a luciferáz aktivitására néhány vegyület (pl . Fe3+) komplexet alakít ki az ATP-vel a talajban az ATP-t ki lehet vonni növények gyökereiből és állati sejtekből is a mikrobiális sejtek mellett (az az ATP interferál a mikrobiális aktivitással) Sok fajta ATP extrakciós módszert használnak: az egyik ilyen: a TCA (triklóracetát) extrakciós módszer

A TCA (triklóracetát) extrakciós módszer A módszer elve: az ATP extrakciója a talajból triklóracetát- foszfát- paraquat keverék segítségével, majd a kivont ATP mennyiségi meghatározása a luciferin-luciferáz rendszerrel Szükséges anyagok és készülékek luminométer és küvetták ultrahangos és egy 12.5 átmérőjű szonda minicentrifuga (Eppendorf centrifuga és csövek) jégfürdő szűrő (Whatman 44) pH mérő finnpipetta és steril csíkok üvegcsövek polipropilén vagy üveg centrifuga csövek Szükséges anyagok és oldószerek EDTA-magnézium arzenát puffer TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat Luciferin-luciferáz keverék belső standard ATP-oldat (10-3 M)

Az oldatok elkészítése EDTA-magnézium-arzenát pufferoldat 1.oldat: 31,2 g Na2HAsO4·7H2O-et kell feloldani 800 ml vízben, majd hozzáadni 10 ml 0,2 M EDTA oldatot 2. oldat: 2,46 g MgSO4·7H2O-t kell feloldani 100 ml desztillált vízben a két oldatot össze kell önteni és 7,4-es pH-ra beállítani 1 M kénsav segítségével , majd 1000 ml-re kiegészíteni desztillált vízzel, hogy az oldat 0,1 M legyen az arzenátra nézve, 10 mM a Mg2+-ra és 2 mM az EDTA-ra   TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat 81,6 g TCA-t és 89,6 g Na2HPO4·12H2O-t kell feloldani 600 ml desztillált vízben 25,8 g paraquat-dikloridot (1,1-dimetil-4,4-bipiridilium-diklorid) kell feloldani 100 ml desztillált vízben és ezt a TCA-Na2HPO4 oldathoz adni az így elkészült oldatot vízzel ki kell egészíteni 1000 ml-re, hogy az oldat 0,5 M legyen a TCA-ra nézve, 0,25 M a foszfátra és 0,1 M a paraquatra Az oldat pH-ja 1,6 lesz és -15 ºC-on kell tárolni

Az oldatok elkészítése Luciferin-luciferáz keverék a tisztított luciferáz és a D-luciferin liofilizált keverékét fel kell oldani 2 ml desztillált vízben injekciós üvegenként a gyártó utasításai szerint (Packard Instrument Co.) ATP belső standard oldat (10-3 M) 5,07 g savmentes ATP-t kell feloldani 7 ml steril extraháló szerben, majd kiegészíteni az extraháló szerrel 10 ml-re minden 0,5 ml ATP oldatot helyezzük egy-egy steril Eppendorf csőbe és tároljuk -20 ºC-on

Az eljárás ATP extrakció 4 adag nedves talaj mintát (<2 mm szemcseméret), amelyek mind 2,5 g szárított talajt tartalmaznak, be kell mérni 50 ml-es polipropilén (vagy üveg) centrifugacsőbe és jégen kell hagyni 25 ml hideg TCA-foszfát-paraquat extrahálószert kell adni mindegyik kémcsőbe Két kémcsőbe belső standard ATP oldatot kell tenni ezek után a talajt 1 percig kell szonikálni a 12,5 mm átmérőjű szondában a Branson Sonifier B12 készülékkel, a szonda csúcsa 1 cm-re legyen a folyadék felülete alatt az ultrahangos kezelés után a kémcsöveket hűteni kell jégen legalább 5 percig, majd szűrni a szűrt kivonatokat lehet tovább használni

Az eljárás Az ATP meghatározása A kalibrációs görbe a talajszűrletethez (50μl) hozzá kell önteni 5 ml EDTA-MG arzenát pufferoldatot és jégen tartani a törzsoldatot a luciferin-luciferáz keverékből 50μl-t a küvettába kell pipettázni, majd a luminométeren lemérni ezt a vakmintát (az intenzitása nem lehet nagyobb 150 RLU/10 s-nál, RLU (relative light unit)) ezután 250 μl-t kell adni a jegelt törzsoldatból a küvettába, majd háromszor mérni egy percen belül a készülékkel a minta intenzitását A kalibrációs görbe  A belső standard ATP oldatból küvettákban hígítással kell készíteni egy sorozatot, amelyek ATP koncentrációja rendre legyen 10-5, 10-6, 10-7 és 10-8 M majd mérni ezen kalibrációs minták intenzitását

Számolás és hasznos tanácsok ATP (μg)/ dwt (g) = (A*ATPS*40) / (B-A) A: a talajszűrlet minta intenzitása ATPS: hozzáadott belső standard mennyisége [μg] B: a belső standard oldatból készült minta intenzitása dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajnak A paraquat használata nem szükségszerű, mivel hozzáadása csak segíti az extrakciós hatásfok javítását. Nagy hátránya a használatának, hogy erősen mérgező anyag és drága is. Nem lehet alkalmazni ezt a módszert, ha a talaj több, mint 10% CaCO3 tartalmaz (semlegesíti a TCA-oldatot) Vizsgálat előtt el kell távolítani a mintából a látható növényi gyökereket és az állati szöveteket, mert a módszer az ezekben található ATP-t is megméri.

Felhasznált irodalom Élelmiszervizsgálati közlemények (1997. XLIII. kötet 2. füzet) http://www.eoq.hu/evik/evik97-2.pdf Redox-potenciál mérésén alapuló gyors mikrobiológiai módszer validálása és ipari alakalmazhatóságának vizsgálata - Nádaskiné dr. Szakmár Katalin http://phd.lib.uni-corvinus.hu/403/1/szakmar_katalin.pdf Mikrobiális fiziológia – Novák Béla http://www.cellcycle.bme.hu/oktatas/mikrofiz/extra/metabolizmus_regulacio.pdf Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Estimation of adenosine triphosphate in soils The trichloroacetic acid extraction method