Akut toxicitásvizsgálat halembrióval OECD 212 Készítette: Fodor Anna

A teszt alapelvei Rövidtávú teszt, amely a halak megtermékenyítésétől a lárvaállapotig terjedő életszakaszt vizsgálja Rövidtávú teszt, amely a halak megtermékenyítésétől a lárvaállapotig terjedő életszakaszt vizsgálja Cél: a vizsgált vegyi anyag letális, szubletális dózisának meghatározása Cél: a vizsgált vegyi anyag letális, szubletális dózisának meghatározása Halembrió; sac-fry állapot [1.]

A vizsgált halfajok Amerikai ponty [2.] Szivárványos pisztráng [3.] Közönsége ponty [4.] Japán rizshal [5.] Zebrafhal [6.]

A vizsgált halfajok 2. Életszakasz hossza [nap] Túlélők a kontrollcsoportban [min%] Fajok Hőmérséklet [°C] Fotoperiódus [h] EmbrióSac-fryTesztidőtartamaSikeres keltetés keltetésUtókeltetés Brachydanio rerio Zebrafish 25 ± nap 8090 Oncorhynchus mykiss Rainbow trout 10 ± nap 6670 Cyprinus carpio Common carp >4 8-9 nap 8075 Oryzias latipes Japanese ricefish 24 ± nap 8080 Pimephales promelas Fathead minnow 25 ± nap 6070

Vizsgált vegyi anyag Tulajdonságai: Gőznyomás Gőznyomás Vízoldhatóság Vízoldhatóság Szerkezeti képlet Szerkezeti képlet Stabilitás Stabilitás Disszociációs állandók Disszociációs állandók Biológiai bonthatóság Biológiai bonthatóság [7.]

A teszt leírása Tesztkamrák Üvegből, vagy más kémiailag semleges anyagból készülnek Üvegből, vagy más kémiailag semleges anyagból készülnek A kamrákat a tesztterületen véletlenszerűen kell elhelyezni A kamrákat a tesztterületen véletlenszerűen kell elhelyezni Külső hatásoktól való védelem Külső hatásoktól való védelem Tesztegyedek kiválasztása Az ajánlott fajokat táblázat tartalmazza Az ajánlott fajokat táblázat tartalmazza A tenyészhalak tartási körülményeit az OECD 210. tartalmazza A tenyészhalak tartási körülményeit az OECD 210. tartalmazza

A tesztkörülmények Embriók, lárvák kezelése Elhelyezés rácson vagy szűrőn Elhelyezés rácson vagy szűrőn Hígító víz Meghatározott összetétel (5. melléklet) Meghatározott összetétel (5. melléklet) pH: max eltérés 0,5 pH: max eltérés 0,5 Állandó összetétel Állandó összetétel Teszt oldat Törzsoldat készítése víz segítségével Törzsoldat készítése víz segítségével Megengedett oldószerek: aceton, metanol, etanol, dimetil-formamid Megengedett oldószerek: aceton, metanol, etanol, dimetil-formamid Félstatikus módszernél: törzsoldat összetétele ne változzon Félstatikus módszernél: törzsoldat összetétele ne változzon Átfolyásos módszer: törzsoldat folyamatosan hígul Átfolyásos módszer: törzsoldat folyamatosan hígul Halembriók [7.]

A tesztkörülmények Időtartam Teszt megkezdése a megtermékenyítés után 30 mp-cel, vagy max. 8 órán belül Teszt megkezdése a megtermékenyítés után 30 mp-cel, vagy max. 8 órán belülFeltöltés 3 párhuzamos minta egy adott koncentráción 3 párhuzamos minta egy adott koncentráción Oxigén koncentráció minimum 60% Oxigén koncentráció minimum 60% Betelepítési arány: min. 0,5 g/l Betelepítési arány: min. 0,5 g/l Fény, hőmérséklet 3.; 4. mellékletben fajonként meghatározva 3.; 4. mellékletben fajonként meghatározva Kísérleti koncentrációk 5 tagú hígítási sor 5 tagú hígítási sor Diszpergálószer: max. 0,1 ml/l Diszpergálószer: max. 0,1 ml/l Kontroll oldat: csak hígító vizet tartalmaz Kontroll oldat: csak hígító vizet tartalmaz Lárva [7.]

Teszthez szükséges készülékek pH mérő pH mérő Oxigénmérő Oxigénmérő Lúgosságmérő Lúgosságmérő Mérleg Mérleg Kémiailag semleges anyagból készült tartályok Kémiailag semleges anyagból készült tartályok [8.] [9.]

Mérés, analitika Vizsgálat alatt folyamatosan mérni kell a vegyi anyag koncentrációját a tesztoldatban Vizsgálat alatt folyamatosan mérni kell a vegyi anyag koncentrációját a tesztoldatban Félstatikus módszer: legalább a legnagyobb és legkisebb koncentráció elemzése, 3-szor a mérés alatt Félstatikus módszer: legalább a legnagyobb és legkisebb koncentráció elemzése, 3-szor a mérés alatt Átfolyásos módszer: ugyanaz, mint a félstatikusnál, ha a vizsgálat időtartama több mint 7 nap mintavételek számát növelni kel Átfolyásos módszer: ugyanaz, mint a félstatikusnál, ha a vizsgálat időtartama több mint 7 nap mintavételek számát növelni kel A mérés alatt 3-szor mérni kell az oldott oxigéntartalmat, pH-t és hőmérsékletet minden koncentrációnál, az összkeménységet és a sótartalmat a legmagasabb koncentrációjú oldatnál A mérés alatt 3-szor mérni kell az oldott oxigéntartalmat, pH-t és hőmérsékletet minden koncentrációnál, az összkeménységet és a sótartalmat a legmagasabb koncentrációjú oldatnál

Megfigyelések Folyamatosan fel kell jegyezni: A kikelt peték és a túlélők számát (első 3 órában 30 percenként), az elpusztult előlényeket el kell távolítani ( peték: áttetszőség csökkenése, színváltozás; embriók: testmozgás hiánya, szívverés megszűnése; lárvák: mozdulatlanság) A kikelt peték és a túlélők számát (első 3 órában 30 percenként), az elpusztult előlényeket el kell távolítani ( peték: áttetszőség csökkenése, színváltozás; embriók: testmozgás hiánya, szívverés megszűnése; lárvák: mozdulatlanság) A rendellenes küllemet A rendellenes küllemet Kóros viselkedést Kóros viselkedést Lárvák hosszát, súlyát Lárvák hosszát, súlyát A vizsgálat végén a következő adatoknak kell rendelkezésre állniuk: Kumulált mortalitás Kumulált mortalitás Egészséges lárvák száma Egészséges lárvák száma Kikelt lárvák száma/nap Kikelt lárvák száma/nap A kikelés időtartama A kikelés időtartama Túlélő állatok hossza és tömege Túlélő állatok hossza és tömege Rendellenes lárvák száma Rendellenes lárvák száma Abnormális viselkedésű lárvák száma Abnormális viselkedésű lárvák száma

A mérés végpontja Regressziós modell alapján megbecsülhető az EC20 és EC50 A NOEC (megfigyelhető hatást még nem okoz) és a LOEC (megfigyelhető hatást okozó legkisebb koncentráció) meghatározható a kontrolloldattal való összehasonlítás által

Eredmények értékelése Statisztikai módszerekkel (regresszióanalízis, varianciaanalízis) Statisztikai módszerekkel (regresszióanalízis, varianciaanalízis) LOEC, NOEC meghatározása becsléssel LOEC, NOEC meghatározása becsléssel LC50 és EC50 meghatározása LC50 és EC50 meghatározásaAhol P: korrigált túlélési % P’: megfigyelt túlélők aránya C: kontrollban lévő túlélők aránya

Források OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS (21 2 ) [1.] [2.] [3.] [4.] [5.] [6.] zebrafish-detector-EmbryoSort [7.] [8.] different-chemical-solutions-vector.html different-chemical-solutions-vector.htmlhttp:// different-chemical-solutions-vector.html [9.] [10.]