Televényféreg-teszt Enchytraeid Reproduction Test OECD 220 Készítette: Rózsa Péter környezetmérnök hallgató Gruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyához

Teszt alapja A tesztférgeket mesterséges talajjal készített talajhígítási sorokba teszik. Tartomány meghatározó (range-finding) teszt: 2 hét, végpont a mortalitás. Hatást mérő teszt (definitive): 6 hét, az összes fiatal egyed a szülőktől származik. Az első három hét után a felnőtt férgeket eltávolítják a tesztedényből, és feljegyzik a morfológiai változásokat További 3 hét után a bábakból kikelt utódokat megszámolják. Az állatok reproduktív hozamát a kontrolltalajon lévő állatok reproduktív hozamával hasonlítják össze. Ebből meghatározzák NOEC-et és ECx-et interpolációval regreszióanalízis segítségével.

Információ a tesztelendő vegyi anyagról Ismerni kell a vegyi anyag vízoldhatóságát és gőznyomását. Plusz információt ad, ha ismerjük a vegyi anyag hidrolízis és fotolízis sebességét. Nem alkalmazható olyan anyagokra, amelynek Henry-állandója nagyobb mint 1, vagy a gőznyomása nagyobb mint 0,0133 Pa, vagyis az illékonyakra.

Teszt validálása A felnőtt mortalitás a tartománykereső teszt végén és a reprodukciós teszt első három hetében nem haladhatja meg a 20%-ot. A teszt kezdetekor 10 felnőttet alkalmazunk edényenként, a teszt végén átlagosan 25 felnőttnek kell lennie edényenként. A fiatalok átlagának varianciája nem lehet több mint 50%.

Referenciaanyag Egyik a karbedazim 360 mg/l (32,18%) aktív összetevőt alkalmaz A reprodukció EC50 értéke 1,2±0,8 mg aktív összetevő/kg száraz talaj intervallumban van. A kontrollsor eredménye alapján ellenőrizzük a tesztorganizmusok megfelelőségét.

A teszt leírása Eszközök Üvegből vagy más kémiailag inert anyagból kell készülnie. 0,20-0,25 l; 6 cm átmérő Átlátszó fedelűnek (pl. üveg vagy polietilén), mert a víz párolgását csökkenti, amíg a légcserét engedünk az atmoszféra és a talaj közt A fedő átlátszó legyen, hogy áteressze a fényt. sztereomikroszkóp pH-mérő és fotométer Analitikai mérlegek hőmérők nedvességellenőrző (nem szükséges, hogy az edénynek legyen fedele) inkubátor vagy kis szoba légkondicionálóval csipesz fotótál

A mesterséges talaj előkészítése 10% tőzegmoha, légszáraz, 2±1 mm szemcseátmérőjű 20% kaolinitagyag 0,3-1% CaCO3 (porítva, analitikai mennyiségben, elsődlegesen a tőzegmoha minőségétől/természetétől függ), hogy a pH 6,0±0,5 legyen Kb. 70% légszáraz kvarchomok (CaCO3 mennyiségétől függően) 50-200 µm szemcseátmérőtől függően

A mesterséges talaj előkészítése Meg kell bizonyosodni, hogy a talaj nem veszélyes-e, ha a szerves széntartalmát 4,5%-ra csökkentjük, és ennek megfelelően megnövekszik a homoktartalma A talaj száraz alkotóelemeit alaposan össze kell keverni legalább 1 hétig. Ezt 2 napig kell tárolni, hogy a pH-ja beálljon. A pH meghatározásához 1 M kálium-klorid-oldatot (KCl) vagy 0,01 M kalcium-klorid (CaCl2)-oldatot 1:5 arányban kell használni Ha savasabb, CaCO3-tal kell pufferolni. Ha túl alkálikus, akkor több keveréket kell hozzáadni, de CaCO3 kizárásával

A mesterséges talaj előkészítése Meg kell határozni a talaj maximális víztartalom-kapacitását; egy vagy két nappal a teszt megkezdése előtt a száraz mesterséges talajt ionmentes vízzel megnedvesítjük, hogy a végső víztartalom kb. felét elérje, hogy a maximális víztartókapacitása 40-60% között legyen. A teszt kezdetén az előnedvesített talajt a tesztkoncentrációk számának megfelelően osztjuk el (és a referenciaanyaggal, ahol alkalmas) és a kontrollokat, amiket a teszthez használnak fel. A nedvességtartalmat a maximális WHC 40-60%-ra kell beállítani a tesztanyagoldat és/vagy desztillált vagy ionmentes víz hozzáadásával A nedvességtartalmat a teszt kezdetén és végén határozzák meg (1050C-on állandó tömegig szárítva), és azt az optimális tartományt, amit a férgek még túlélnek. A talaj nedvességtartalmát ellenőrizni kell; a talajt a kezünkben finoman összenyomjuk, ha a víztartalom kis vízcseppekben megjelenik az ujjak közt, akkor alkalmas a tesztre.

A tesztállatok kiválasztása Enchytraeus albidus (fehér féreg) az Enchytraeide családba, Oligochaeták rendjébe, Annelidák törzsébe tartozik. Az echytraeidák egyik leghosszabb faja, 35 mm hosszú is lehet. Világszerte megtalálható, a tengervízben, édesvízben, földön, főképp korhadó szerves anyagokon (hínár, komposzt) és ritkán réteken. Széles ökológiai toleranciájának és néhány morfológiai változatosságának köszönhetően különböző fajtái léteznek. Kereskedelmileg mint haltápanyag kapható. Ha a kultúra megfertőződik, általában kisebbek, fajták (1) (19). Ha a szennyeződés megtörténik, minden férget Petri-csészében vízzel le kell mosni. Az Enchytraeus albidus hosszú felnőtt példányai (sztereomikroszkóp használatával) elkülöníthetők, hogy egy új kultúrát elkezdhessünk, és minden egyéb férget elválasszunk. Könnyen tenyészthető a szerves anyagok széles skáláján. Életciklusuk lerövidül, mikor fejlődésük során elérik 33 napot (180C) és 74 napot (120C-on). Csak azok a kultúrák tarthatók használhatók fel a teszthez, anmelyeket laboratóriumban problémamentesen lehetett tartani legalább 5 hétig (egy generáció). Használhatók még pl. E. buchholzi és E. crypticus. Meg kell jegyezni, hogy más faj használatakor a fajoknak tisztán azonosíthatónak kell lenniük.

Tesztállatok A tesztben használt állatok felnőtt férgek. Ikrájuk van (fehér folt) a clitellum területen, és kb. ugyanolyan méretűek (kb. 1 cm hosszúak). A tenyészkultúrákat nem szükségszerű összehangolni Ha az enchytraeidák nem tenyészthetők ugyanazon a talajtípuson és ugyanolyan körülmények közt, akkor akklimatizálni kell őket 1-3 napig is akár. Ha több felnőttet alkalmazunk, mint ami a teszthez szükséges, kezdetben akklimatizálni kell őket a teszthez, hogy elválasszuk őket a károsodott vagy a tesztre alkalmatlan fajoktól. Az akklimatizált időszak végén csak azok a férgek maradnak meg, amiknek petéjük van, és amelyek nem térnek el a hagyományos viselkedéstől (pl. megpróbálnak elmászni a talajról). A férgeket óvatosan elveszik csipesszel, és áthelyezik egy Petri-csészébe, ami kismennyiségű édesvizet tartalmaz, amit frissen kell előkészíteni. A férgek megfigyelhetőek sztereomikroszkóp alatt, és néhány az, amelyik nem tartalmaz petét, elkülönülnek. Figyelni kell, hogy elválasszuk és elkülönítsük az atkáktól, amik megfertőzhetik a kultúrákat. Azok az egészséges férgek, amiket nem használunk a tesztre, visszakerülnek az alapkultúrához.

A tesztkoncentrációk előkészítése Tesztanyag feloldása vízben (ionmentesben). Annyi ionmentes vízben oldjuk fel, amennyi elég minden egyes koncentráció ismétlésére. Ajánlatos annyi vizet használni, hogy elérjük a kívánt nedvességtartalmat, pl. a maximum WHC 40-60%-át. A tesztanyag minden oldatát alaposan átkeverjük egy előzetesen megnedvesített talajjal, mielőtt belehelyeznénk a tesztedénybe. Ha nem vízoldható a tesztanyag: Ha szerves oldószerben oldódnak, a tesztanyagot először feloldjuk egy közvetítő közegben (pl. aceton), és ezt összekeverik kb. 2,5 g apró kvarchomokkal, majd a vivőközeget legalább 1 óráig párolják. A kvarchomok-tesztanyag-keveréket hozzáadják az előnedvesített talajhoz, elkeverik, ionmentes vizet adnak hozzá a kívánt nedvesség eléréséhez. Végül behelyezik a tesztedénybe. Ha szerves oldószerben és vízben is kevéssé oldódnak, akkor 2,5 g egyenértékű apró kvarchomokot teszedényenként összekevernek a tesztanyag mennyiségével, hogy a kívánt koncentrációt elérjék. Ezt a keveréket hozzáadják az előzetesen nedvesített talajhoz, és alaposan elkeverik, miután hozzáadtak annyi ionmentes vizet, hogy a nedvességtartalmat elérjék. A végső keveréket szétosztják a tesztedények közt. A folyamatot minden egyes tesztkoncentrációra megismétlik, és elvégzik a kontrollra is egyaránt. Az olyan anyagok, amik nagyobbak 1000 mg/kg száraz talajtömeg koncentrációnál, nem alkalmasak a tesztre.

Tesztcsoportok és kontrollok Minden tesztkoncentrációhoz adott mennyiségű teszttalajt - 20 g száraz súlyra vonatkoztatva - helyeznek a tesztedénybe. A kontrolltalajokat - a tesztanyagok nélkül - is elkészítik. Ételt adnak minden edénybe. 10 férget véletlenszerűen elhelyeznek minden tesztedénybe. A férgeket óvatosan áthelyezik minden tesztedénybe, és elhelyezik a használni kívánt talaj felszínére, pl. csipeszekkel. Az ismétlések száma függ a tesztkoncentrációkhoz és a kontrollokhoz használt teszt típusától. A tesztedényeket véletlenszerűen helyezik el a tesztinkubátorba, és ezeket a helyeket hetente újra megkeverik. Ha egy vivőközeget használnak a tesztanyagra, egy kontrollsorozatot – amiben kvarchomok van feloldva az oldószerben – kell futtatni a tesztsorozaton felül. Az oldószerkoncentrációnak meg kell egyeznie, amit a tesztedényekben használtunk, ami a tesztanyagot tartalmazta.

Tesztkörülmények Teszthőmérséklet 20±20C. Hogy a kukacok ne hagyják el a talajt, a tesztet irányított világos-sötét ciklusok alatt kell végezni (16 óra világos-8 óra sötét) 400-800 lux megvilágítással Talajnedvesség nyomonkövetése: edények lemérése a teszt kezdetén, majd hetente. Tömegveszteséget ionmentes víz hozzáadásával kell pótolni. Nedvesség csökkenthető, ha a tesztinkubátorban magas páratartalmú levegőt (>80%) tartunk fenn. Nedvességtartalmat és a pH-t is mérni kell mindkét tesztben a kontrollra és a kezelt talaj minden koncentrációjára egyaránt.

Etetés 50 mg összecsavarodott zabot kell alkalmazni, amit a talajba kevernek bele. Hetente a 21. napig etetni kell a férgeket. Az etetés nem fejeződik be a 28. napon addig, amíg a felnőtteket nem vették el erről a helyről, és a fiatal férgeknek szükségük van relatíve kis mennyiségű hozzáadott ételre ezen a ponton túl. Az etetés a teszt alatt 25 mg összecsavart zabot / edény tartalmaz, a férgeket gondosan helyezzük a talaj felszínére, így elkerüljük, hogy megsérülnek. Azért, hogy csökkentsük a gombák növekedését, a zabpelyheket a talajba kell ásni kismennyiségű talajjal borítva. Ha az ételt nem fogyasztják el teljesen, akkor mennyiségét csökkenteni kell.

Range-finding teszt 0,1; 1; 10; 100; 1000 mg/kg (száraztalaj-súlyra vonatkoztatva). Egy ismétlés mindegyikhez szükséges lehet. 2 hetes teszt. Férgek mortalitását megállapítjuk Egy féreg akkor tekinthető halottnak, ha mechanikai stimulusra nem reagál. A felnőttek viselkedésében lévő változásokat (pl. nem tudja beásni magát a talajba; mozdulatlanul fekszik a tesztedény üvegfalának dőlve) és morfológia (pl. nyílt sebek jelenléte) fel kell jegyezni. LC50 úgy határozható meg, hogy vesszük a mortalitási adatok geometriai átlagát. A koncentricióintervallumok felállításában a definitív tesztre a reprodukcióra gyakorolt hatások kisebbek az LC50-nél egy 10-es faktorral. 4 ismétlést végzünk minden tesztanyag-koncentrációra és egy adekvát koncentrációszámítást, ami legalább 4 statisztikailag különböző átlagot eredményez ezekre a koncentrációkra ajánlott. Kontrollgra használják is ugyanezeket érdemes alkalmazni.

Kivitel a definitív reprodukciós tesztre Erre 3 lehetőségünk van: NOEC meghatározására legalább 5 koncentrációsorozatot kell tesztelni. 4 ismétlést minden koncentrációra plusz 8 kontrol ajánlott. A koncentrációkat 1,8-at meg nem haladó faktorral kell beszorozni. Az ECx (pl. EC10, EC50) meghatározásához legalább 5 koncentrációt kell tesztelni, és a koncentrációkat egymás mellé elhelyezni ECx-ek szerinti növekvő sorrendjébe, hogy interpolálhassuk, és ne az extrapoláljuk. Minden egyes tesztkoncentrációra legalább 4 ismétlés és 4 kontrollismétlés ajánlott. A faktor szór, pl. kevesebb vagy egyenlő 1,8-cal az elvárt intervallumban, és 1,8 fölé is mehet magasabb és alacsonyabb koncentrációknál. Egy egyesített megközelítés megengedi mind a NOEC, mind az ECx meghatározását. 8 koncentrációt kell alkalmazni a geometriai sorozatokban. 4 ismétlőt minden kezeltre plusz 8-at kontrollra ajánlott. A koncentrációkat olyan faktorokkal kell szorozni, amik nem érik el az 1,8-at.

ECx-ek meghatározása

Definitív teszt 10 felnőtt férget/tesztedény kell használni. Ételt adnak a tesztedényekbe a teszt kezdetén, majd hetente egyszer a 21. napig. A 21. napon a talajmintákat óvatosan kezelik, és az élő felnőtt férgeket megfigyelik és megszámolják, és a viselkedésbeli változásaikat (pl. a földbe nem tudnak lemenni; mozdulatlanul fekszenek a tesztedény üvegének) és a morfológiát (pl. nyílt sebek) feljegyzik. Ezután minden felnőtt férget elvesznek a tesztedényből és a teszttalajról. Ha teszttalaj tartalmaz néhány bábot, amiket termeltek, azokat inkubálják még 3 hétig ugyanazon tesztkörülmények között kivéve, hogy az etetés csak a 35. napon történik meg 25 mg összecsavart zab/edény). 6 hét után az új kikelt férgeket megszámolják. A metodika Bengal piros festésen alapul, habár más nedves (de nem melegített) extrakciós és flotációs technikák is hatásosnak bizonyultak. Bengáli piros festés inkább ajánlott, mert a nedves extrakció egy talajszubsztrátból a zavarodottság miatt gátolt, amiket a szuszpendált agyagszemcsék idéznek elő. Limitáló teszt 37. Ha nincs megfigyelhető hatás a magasabb koncentrációknál a széleskörű-kereső tesztekben (pl. 1000 mg/kg), a reprodukciós teszt végrehajtható mint egy limitáló teszt, 1000 mg/kg-ot használ fel sorrendben, hogy bizonyítsa, a NOEC a reprodukcióra nagyobb mint ez az érték.

A teszt összefoglalása Idő Range-finding teszt Deifinitív teszt 7 nap vagy kevesebb Mesterséges talaj elkészítése (száraz alkotók összekeverése) 5. nap A mesterséges talaj pH-jának ellenőrzése   Megmérni a talaj max WHC-jét 5. naptól Csoportférgek akklimatizációra 3. naptól Férgek akklimatizálása legalább 24 órán át 1. nap Előnedvesített mesterséges talaj és szétosztani frissekre 0. nap Előkészíteni az alapoldatokat Alkalmazni a tesztanyagot Megmérni a tesztszubsztrát tömegét tesztedényekbe Elkeverni az ételt Behelyezni a férgeket Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmat 7. nap Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát

A teszt összefoglalása Idő Range-finding teszt Deifinitív teszt 14. nap Meghatározni a felnőtt mortalitást Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmát   Megbecsülni a fiatalok számát Etetés Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmat 21. nap Megfigyelni a felnőtt viselkedést Elvenni a felnőtteket 28. nap Nem etetni 35. nap 42. nap Megszámolni a fiatal férgeket

Jegyzőkönyv Tesztanyag Fizikai és, ahol lehet, fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. vízoldhatóság, gőznyomás); A tesztanyag kémiai azonosítása IUPAC nomenklatúrának megfelelően, CAS-szám, struktúrális formula és tisztaság A minta lejárati dátuma/felhasználhatósági ideje Tesztfajok A felhasznált tesztállatok: fajok, tudományos név, organizmusok és tenyésztési kondíciók adatai Tesztkondíciók a mesterséges talaj előkészítése és alapanyagok a tesztanyag felhasználásának módszere a tesztkörülmények leírása beleértve hőmérsékletet, nedvességtartalmat, pH-t, stb. a kísérleti felépítés és folyamat teljes leírása Teszteredmények: a felnőtt férgek halálozása 2 hét után és a fiatalok száma a range-finding teszt végén; a felnőtt férgek halálozása 3 hét után, és fiatalok teljes életciklusa a definitív teszt végén. Néhány megfigyelt fizikai vagy patológiai szimptómák és viselkedésváltozások a tesztorganizmusokban; LC50, a NOEC és vagy ECx (pl. EC50, EC10) a reprodukcióra, ha néhány közülük alkalmazható konfidencia-intervallummal, és a ráillesztett modell rajza felhasználva a számításukra minden információ és megfigyelések segíthetnek az eredmények kiértékelésében.

Felhasznált irodalom OECD iLibrary - Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test http://www.oecd-ilibrary.org/docserver/download/fulltext/9722001e.pdf?expires=1291765462&id=0000&accname=freeContent&checksum=FE904F3D99C7CB01C454E491D8719C9F Képek forrása http://www.grimas.hu/hu/labortechnika/Lapok/Laboratriumi_mrleg_ABS_2204.aspx http://theaquariumwiki.com/Enchytraeus_albidus http://www.allthingsorganic.com/How_To/12.asp http://www.firstfish.de/cms/front_content.php?idcat=57&idart=147