A légúti bakteriológia nehézségei Mlinkó Tamás Corden Kft. Mycobacteriológiai Referencialaboratórium

Miért fontos terület a légúti diagnosztika? A fertőző betegségek legnagyobb hányadát teszi ki A járóbeteg ellátásban a legtöbb beteg légúti panaszokkal fordul orvoshoz A kórházi eredetű fertőzések jelentős része pneumónia A tünetek spektruma a legenyhébb náthától az életet veszélyeztető nosocomiális tüdőgyulladásig terjedhet A legtöbb fölös antibiotikum felhasználás ezen területen történik

A légúti infekciók osztályozása Felső légúti fertőzések sinusok gyulladásai (orrüreg, orrmelléküreg, arcüreg, homloküreg) garat és mandulák gyulladásai gégefedő gyulladása Alsólégúti fertőzések bronchitis (COPD) pneumonia (területen szerzett, nosocomiális)

A diagnosztikai folyamat lépései 1. Mintavétel 2. Feldolgozás, identifikálás, antibiogram 3. Értékelés, interpretálás

A mintavétel szabályai I. Az egyik legfontosabb fázis, hiszen ha hibás, a további feldolgozásnak nem sok értelme van Alapkérdések: honnan, mikor, mennyi vizsgálati anyagot vegyünk Honnan: általában az adott anatómiai régióból, de pl. atypusos pneumóniánál szerológia hasznosabb lehet Mikor: a kórokozó minél nagyobb mennyiségben és minél életképesebb állapotban legyen jelen: antibiotikum kezelés megkezdése előtt, hemokultúra vételénél hidegrázáskor Mennyit: ha kevés a minta, kevesebb a benne lévő kórokozó is, és nem jut minden szükséges feldolgozási útvonalra Az optimális minta típusát mindig az adott kórkép, a kimutatni kívánt kórokozó és a detektálási módszer együttesen határozza meg

A mintavétel szabályai II. Tárolás, szállítás Törekedjünk minél hamarabb a laboratóriumba juttatni a mintát Amennyiben 2-3 órán belül ez nem sikerül, általában hűtőszekrényben tárolható (4Cº), de ha érzékenyebb kórokozót gyanítunk (meningococcus), szobahőn tartsuk, vagy tegyük transzporttáptalajba, hemokultúra palackba

Kórokozók kimutatásának lehetőségei A baktériumok direkt kimutatása Direkt kenet festése ( Gram, Ziehl-Neelsen, Neisser, fluoreszcens festés ) Tenyésztés általános (véres agar, csokoládé agar), szelektív ( Löffler, CYE ) és differenciáló (eozin-metilénkék) táptalajokon

Kórokozók kimutatásának lehetőségei Baktérium valamely alkotórészének kimutatása DNS, RNS – nukleinsav hibridizáció, nukleinsav amplifikáció ( PCR ) Anyagcserevégtermékek, sejtfalalkotók – kromatográfiás módszerek Antigénkimutatás vizeletből – S. pneumoniae, Legionella pneumophila 1. szerotípus

Kórokozók kimutatásának lehetőségei A baktériumok indirekt kimutatása az ellenük termelt antitestek detektálása - szerológiai módszerek (ELISA, IFA) - gamma-interferon termelés vizsgálata – IGRA (Quantiferon, T-spot)

A módszerek összehasonlításához két leggyakrabban használt paraméter: Érzékenység (szenzitivitás)% = valódi pozitív minták száma / (valódi pozitív+ ál-negatív minták száma) Fajlagosság (specificitás)% = valódi negatív minták száma / (valódi negatív+ál-pozitív minták száma)

Leggyakoribb légúti kórokozók csoportosítása mikrobiológiai szempontból Könnyen és gyorsan tenyészthető baktériumok: S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, S. aureus, bélbaktériumok, P. aeruginosa, A. baumannii Nehezen vagy nem tenyészthető baktériumok: Mycoplasma, Chlamydophila, Legionella, Corynebacterium, Bordetella, Neisseria, Nocardia, Actinomyces Csak speciális festékkel vagy egyáltalán nem festődő baktériumok: Mycoplasma, Chlamydophila, Legionella, Bordetella, Nocardia, Mycobacterium megoldás: különleges festékek használata, szelektív táptalajok használata, inkubálási idő növelése, szerológiai módszerek, molekuláris módszerek, antigénkimutatás

A feldolgozás menete A feldolgozáshoz használt táptalajok Általános táptalajok: a baktériumok, gombák nagy része kitenyészik rajtuk, birka-, vagy marhavért tartalmaznak, véres agar (V), csokoládé agar (CS), Schaedler agar (Sch) anaerob bakt.-hoz, gombákhoz antibiotikummal kiegészített Sabouraud agar (Sab) Szelektív táptalajok: kiegészítő anyagok hozzáadásával bizonyos nem kívánt baktériumok növekedése gátolható (CS+ vancomycin, Uriselect) Differenciáló táptalajok: a baktériumtelepek megkülönböztethető külsővel rendelkeznek a táptalajon-MacConkey (MAC), eozin-metilénkék (EM) Gram-negatív baktériumok esetén

A feldolgozás menete A mintákból direkt kenetet készítünk és leoltjuk V, CS, EM/MAC , anaerob minták esetén CM dúsító és szilárd Sch is leoltásra kerül Ezeken felül ha különlegesebb kórokozókra is lehet számítani vagy az orvos kéri, megfelelő szelektív táptalajokra is leoltunk, vagy az inkubálás körülményeit és idejét módosítjuk Leoltás után a lemezeket 5-10% CO2 tartalmú termosztátban inkubáljuk másnapig, az anaerob leoltásokat anaerosztátba tesszük

A feldolgozás menete A kitenyészett baktériumok közül az általunk kórokozónak tartottakat meghatározzuk és érzékenységi vizsgálatot kérünk Az identifikálás történhet: Hagyományos biokémiai módszerekkel kémcsőben, anyagcserevégtermékeket, szerves és szervetlen anyagok hasznosítását alapul véve Identifikáló panelek: a panel vályulataiban liofilizált formában vannak jelen a szubsztrátumok, ezekhez kell nekünk a baktériumszuszpenziót hozzáadni, kiértékeléshez táblázatok, vagy számítógépes program

A feldolgozás menete Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok Legegyszerűbb és legolcsóbb a korongdiffúziós módszer: adott koncentrációjú antibiotikumkorongot a MH vagy V táptalajra szélesztett baktériumpázsitra helyezünk és másnap megvizsgáljuk, van-e gátlási zóna, eredmény érzékeny, mérsékleten érzékeny vagy rezisztens Pontosabban is meghatározható egy antibiotikum minimális gátló koncentrációja (MIC) agarhígítással, leveshígítással vagy E-teszttel Az eredményeket jelenleg az EUCAST (European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ajánlásai alapján interpretáljuk

A direkt kenet jelentősége Többféle festési eljárás Gram-festés: a baktériumok többsége megfestődik Ziehl-Neelsen: a saválló baktériumok kimutatására (Mycobacterium) Immunfluoreszcens festés: Legionella Köpetnél kettős szerepe van: a laphámsejt és fehérvérsejt arány alapján a minőség eldöntése Látunk-e dominánáló flórát Segít az identifikálásban, mert a táptalajon a telepek nem feltétlenül egyértelműen felismerhetőek Kicsi az érzékenysége, nagy mennyiségben kell hogy tartalmazza a kórokozót

A direkt kenet jelentősége I. Eset 1. A véres agaron nagy csíraszámban K. pneumoniae tenyészett ki Milyen eredményt adok ki?

A direkt kenet jelentősége I. Eset 1. A kenetben csak laphámsejtek látszanak, tehát a minta feldolgozásra alkalmatlan

A direkt kenet jelentősége I. Eset 1. A kenetben sok fehérvérsejt és sok Gram-negatív tokos pálca A baktériumot identifikálom és antibiogramot kérek belőle

Felső légúti infekciók diagnosztikai problémái A leggyakrabban előforduló kórkép a torok- és/vagy mandulagyulladás ( tonsillitis, pharyngitis) Nagyrészt vírusok okozzák, a bakteriális kórokozók közül legtöbbször a Streptococcus pyogenes, de kevésbé szokványos speciesek is előfordulhatnak: Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium diphteriae, Utóbbiak esetén szelektív táptalajok ( Thayer-Martin, Löffler ) használata és inkubációs idő módosítása szükséges

További kórképek Középfülgyulladás (otitis media): lehetséges kórokozók a S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, S. pyogenes, S. aureus, bélbaktériumok, krónikus esetben ezekhez társulhatnak anaerobok Anatómiai közelsége miatt agyhártyákra is átterjedhet Orr- és torokváladék nem alkalmas minta, tympanocentesis vagy vakuténeres mintavétel A koponyacsont üregeinek gyulladásai (sinusitis) Kórokozók: mint a középfülben, nosocomiális esetben Gram-negatív baktériumok is Orrváladék nem jó minta, sinusaspirátum kell, anaerob tenyésztésre is alkalmas

A gégefedő gyulladása (epiglottitis) Kisgyermekek betegsége, ritka, de veszélyes Szinte kizárólag a H. influenzae b típusa okozza, és mivel a vérben is megjelenik, a hemokultúra releváns minta lehet Plaut-Vincent angina Egyoldali fekélyes folyamat, melyet Treponemák és Fusobacteriumok együttesen okoznak A tenyésztés itt nem célravezető, mert aerob körülmények közt nem tenyésző és lassan növő baktériumokról van szó A területről vett direkt kenet festése lehet informatív

A direkt kenet jelentősége Plaut-Vincent angina A kenetben Treponemák és Fusobacteriumok láthatók, melyek lassan és nehezen tenyésznének ki

Alsó légúti fertőzések leggyakoribb kórokozói bronchitis : nagyrészt vírusok, M.pneumoniae, C. pneumoniae, Bordetella pertussis COPD: S. pneumoniae, H. influenzae, tüdőgyulladás: közösségben szerzett: S. pneumoniae, H. influenzae, M. catarrhalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes, M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella pneumophila, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, M. tuberculosis nosocomiális: bélbaktériumok, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus – sokszor multirezisztensek (ESBL, MRSA, MACI)

Alsó légúti infekciók problémai Leggyakoribb mintatípus a köpet Az eredményesség javítása érdekében citológiai szűrésen megy keresztül: ha laphámsejt>10 és fehérvérsejt<10 1átótérben 100x nagyítás alatt, alkalmatlan (neutropénia!) Sajnos szennyeződik a száj baktériumflórájával, de ha jó a minősége (fvs>25, lhs<10), és domináló baktériumflórát látunk benne, jó a specificitása, érzékenysége kevésbé magas Kórokozó/kolonizáció probléma Könnyen festődő és nagy csíraszámban jelenlevő baktériumok esetén jó a prediktivitása Általános probléma, hogy a betegek egy része nem tud köpetet produkálni, ha mégis sikerül, azok 30-40%-a nem alkalmas

S. pneumoniae

S. aureus

A vizelet antigénteszt két kórokozó kimutatását teszi lehetővé: Ezekben az esetekben meg lehet próbálni az eszközös mintavételt (bronchoszkópia, tűbiopszia) kvantitatív tenyésztéssael, vagy nem légúti anyagból dolgozni (vizelet, hemokultúra, szérum) Hemokultúrát minden pneumonia esetén javasolnak, hiszen kevés a fals pozitív A vizelet antigénteszt két kórokozó kimutatását teszi lehetővé: A S. pneumoniae sejtfalának C-poliszacharidját és a L. pneumophila 1. szerotípusának sejtfal lipopoliszaharidját (LPS) tudja detektálni, inkább a bakterémiás pacienseknél használható Szerológia: főleg „atypusos” kórokozóknál használatos, savópár szükséges, ezért csak retrospektív diagnózist ad

Atypusos kórokozók kimutatási lehetőségei Szerológia: savópárból (akut és gyógyuló szak) IgG titeremelkedés, vagy akut IgM emelkedés - Mycoplasma, Chlamydia, Francisella, Legionella Tenyésztés szelektív táptalajon: Francisella, Legionella, Mycobacterium, Yersinia, Nocardia Nukleinsav amplifikáció: PCR közvetlen a mintából - Mycoplasma, Chlamydia, Legionella Speciális festés: Legionella, Nocardia, Mycobacterium

Legionella antigénkimutatás vizeletből

Legionella Legionella kimutatása köpetből immunfluoreszcens festék segítségével (DIF)

A direkt kenet jelentősége I. Eset 2. A táptalajon 48 óra múlva sem nőtt semmi, tehát köpetként ki mehetne a negatív eredmény A kenetben viszont Gram-pozitív gyengén festődő fonalak láthatók, ez Nocardiára vagy Actinomycesre utal Teendő: tovább inkubálom és anaerob táptalajokra is leoltom

A direkt kenet jelentősége I. Eset 3. A Gram-kenetben gyengén és szakaszosan festődő pálcák láthatók, a táptalajokon semmi nem nőtt 48 óra után Teendő: ez Mycobacterium gyanús, ezért ZN festést kérek

A direkt kenet jelentősége I. Eset 3. A ZN festés eredménye pozitív, tehát elindítom a mycobacteriológiai tenyésztést

Kórházban szerzett (nosocomiális) pneumoniák A felvételt követő 3. nap után alakul ki A kórházi fertőzések közt a második leggyakoribb ( 15-20%) és legmagasabb mortalitású A kórokozók köre a közösségben szerzettek mellett kibővül a tipikus kórházi környezetben fellelhető baktériumokéval Különböző rizikófaktorok befolyásolják a kórokozó jellegét: alapbetegség, antibiotikum kezelés, immunállapot, eszközös beavatkozások, katéterek, kanülök, intubálás, aktuális kórházi flóra Leggyakrabban a lélegeztetett betegek körében fordul elő

Köpet vagy tracheaváladék nem optimális, nehéz eldönteni, hogy kolonizációról vagy infekcióról van szó, ezért kvantitatív tenyésztésre alkalmas mintát kell küldeni, ez növeli a szenzitivitást és specificitást Bronchoalveoláris lavage (BAL) vagy védett kefével (PSB) vett minta ajánlott, a kórokozónak 103-104 CFU/ml csíraszámmal kitenyésző baktériumokat tekintjük Hemokultúra vétele mindenképp ajánlott Jellegzetesen kórházi pneumoniát okozó baktériumok: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii és ezek multirezisztens formái, multirezisztens Gram-negatív bélbaktériumok (ESBL, KPC), MRSA, egyéb Gram- negatívok-Stenotrophomonas maltophilia, Achromobacter sp., Burkholderia cepacia

Infekciók immunkárosodott betegekben A szokványostól eltérő kórokozó spektrum az immunkárosodás jellegétől függően, opportunista kórokozók is, súlyosabb és kevésbé típusos lefolyás, invazív mintavétel kvalitatív tenyésztéssel javasolt Neutropénia: S. aureus, bélbaktériumok, gombák Humorális immundefektus (leukémiák, limfómák): tokos baktériumok (S. pneumoniae, H. infuenzae, N. meningitidis) Celluláris immundefektus(HIV, immunszuppresszív kezelés): intracellulárisan szaporodó baktériumok- Salmonella, Mycobcterium, Legionella, Nocardia, Listeria, vírusok, gombák

Kórokozók cysticus fibrosisban (CF) Bizonyos baktériumok preferálják és alkalmazkodnak a CF-es betegek légútaiban uralkodó környezethez (sűrű, viszkózus nyák) Leggyakoribb a Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, H. influenzae, ritkábban Burkholderia cepacia Nem szokványos teleptípusok, sokszor csak több nap után nőnek ki Inkubálás idejének növelése (legalább 5 nap), szelektív táptalajok

A direkt kenet jelentősége I. Eset 4. A táptalajon 48 óra után nem nőtt semmi, de a Gram-kenetben tokos G- pálcák láthatók, és a beteg cysticus fibrosis-ban szenved Teendő: tovább inkubálom a mintát

A direkt kenet jelentősége I. Eset 4. A 3. Napon megjelenik a nyálkás telepekben növő Pseudomonas, ami ezen betegekben gyakori

Rezisztencia problémák S. pneumoniae: penicillin- és makrolid rezisztencia MRSA: megjelent a közösségben szerzett infekciók között is - CA-MRSA ESBL-termelő bélbaktériumok, karbapenemáz- termelő (KPC) bélbaktériumok, Pseudomonasok és Acinetobacterek Csak polymixin-érzékeny Pseudomonasok és Acinetobacterek