T-limfocita aktiválás, 9. szeminárium/gyakorlat Az immunkompetens sejtek funkcionális aktivitásának vizsgálata, blasztos transzformáció (LPS és ConA aktiválás), poliklonális B- és T-limfocita aktiválás, ELISPOT módszer

A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése Témák: A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával lektinek által indukált aktiváció α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) 2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek proliferatív válasz 3H-timidin beépülés CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) 3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT Intracelluláris citokin festés Pentamer (vagy tetramer) technika

A humorális immunválasz szakaszai felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció Antitest termelés Segítő T-sejt, más stimulus Klonális expanzió IgG-t expresszáló B-sejt Izotípus váltás Antigén Nyugvó IgM+, IgD+ érett B-sejt Aktivált B-sejt Affinitás érés Nagy affinitású IgG Nagy affinitású Ig-t expresszáló B-sejt Memória B-sejt

A T-sejt válasz szakaszai Antigén felismerés Aktiváció Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Makrofágok, B-sejtek, más sejtek aktivációja Naív CD4+ T-sejt CD4+ Effektor T-sejt Citokinek (pl. IL-2) CD4+ Memória T-sejt Naív CD8+ T-sejt Fertőzött target sejtek ölése, makrofág aktiváció Citokinek (pl. IL-2) CD8+ Effektor T-sejt (CTL) IL-2 is the main AUTOKRINE growth factor for T-cells. High affinity IL-2 Rec also upregulated. A similar APC-produced cytokine, IL-15, stimulates proliferation of CD8+ cells, especially memorycells of the CD8+ subset. BEFORE ANTIGEN EXPOSURE: the number of spec. clones is one in 105-106 lymphocytes. AFTER clonal ecpansion this ratio may be 1:10 for CD8+ and 1:100 to 1: in 1000 for CD4+ T-cells CD8+ Memória T-sejt Nyirokszervek Perifériás szövetek

B-sejt receptor komplex általi jelátvitel Membrán Ig keresztkötése antigénnel Tirozin foszforiláció PLC aktiváció GTP/GDP csere a Ras-on, Rac-on Biokémiai intermedierek Emelkedett ic Ca2+ Diacilglicerol Aktív enzimek Ca2+ dependens enzimek Transzkripciós faktorok

T-sejt receptor komplex általi jelátvitel Adapter fehérjék TCR mediált jelek indítása PLC1 aktiváció GTP/GDP csere a Ras-on Biokémiai intermedierek Emelkedett ic Ca2+ Diacilglicerol Késői jelátvitel enzimei kalcineurin MAP kinázok Transzkripciós faktorok Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható

Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi. Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében B-sejt (egér) T-sejt T-sejt TLR4 Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

Poliklonális B-sejt aktivátorok és hatásaik T-sejt függés Ig szekréció Humán B-sejt PWM (pokeweed mitogen) nincs van SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) EBV (transzformáló hatású is) Anti-Ig citokinek jelenlétében Egér B-sejt LPS PWM PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) Poliklonális T-sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis Concanavalin A (ConA) Phaseolus vulgaris anti-CD3 monoklonális ellenanyag

Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) - Álkörmös Termését borszínezésre használták, aztán rájöttek, hogy mérgező (triterpénszaponin, és mitogén lektin) Mo.-n dísznövényként tartják Chenopodiales (libatopvirágúak) Phytolaccaceae (álkörmösfélék)

Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean - Kardbab

Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – (vetemény) bab

A limfociták aktivációja Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria Citokin szekréció ELISA, ELISPOT - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfociták aktivációja Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

Western blot Specifikus fehérjék jelenléte, vagy akár azok foszforilációs állapota vizsgálható vele Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 106 sejt szükséges a vizsgálathoz

Bruton-féle tirozin kináz (BTK) hiányának kimutatása Western blottal PBMC lizátumokon végezték a vizsgálatot. C: kontroll, P-k: különböző betegek mintái. P14-1és P14-2 ikrek. X- kromoszómához kapcsolt (Bruton-féle) agammaglobulinemia Az immunglobulinok és az érett B sejtek szinte teljes hiánya jellemzi.

Bruton-féle tirozin kináz (BTK) hiányának kimutatása áramlási citometriával BTK expresszió áramlási citometriás vizsgálata egy XLA-s beteg és édesanyja mintáiból. X tengely: BTK; Y tengely: CD20. Futatani T et al. Blood 1998;91:595-602

Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca2+ szint meghatározása A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció növekedése fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható. /Fluo-3 vagy az Indo-1/ példa – intracelluláris Ca2+ jel egy sejtben kimutatva: antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál (klikk a képre)

A génaktiváció vizsgálata A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható pl. citokin gének aktivációja módszer: RT-PCR, QRT-PCR sejtek  RNS izolálás RNS  (reverz transzkriptáz)  cDNS TaqMan probe: A primer pár által meghatározott szakasz közé hibridizálni képes rövid oligo. Egyik végén egy fluorokróm, a másik végén egy quencher. Amíg egymás közelében vannak, a quencher nem engedi a fluorokrómot fényt leadni (mechanizmus – FRET). A Taq polimeráz a ciklus során előrehaladva a DNS-en az exo?nukleáz aktivitásával lehasítja a TaqMan próba bázisait így felszabadítja a fluorokrómot a quencher hatása alól. A ciklusok során egyre több próba hasad el, a fluoreszcencia emelkedik. cDNS  (PCR)  hossz és mennyiség meghatározás RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm  SYBR green)

A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker” pl. CD4) citokinek

Eredmény: Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blot-ét (pl. hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)

Az intracelluláris festés fixált sejtekkel történik. Kettős specificitású ellenanyag felhasználásával a sejtek által termelt citokinek natív mintákon is vizsgálhatók. (nem elterjedt, körülményes, de szép módszer!) az egyik Fab a sejt valamely jellemző molekulájára specifikus a másik Fab citokinspecifikus csapdaként szolgál a citokint egy jelzett másodlagos ellenanyaggal mutatják ki hibrid ellenanyag!!! a 2 Fab rész eltérő specificitású

Enzyme Linked Immuno-Spot ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot elve hasonlít az ELISA-hoz eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására érzékenység: 1/300 000 sejt az első lépéseket aszeptikus körülmények között kell végezni

ELISPOT A mérés menete - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása (aktiválás, inkubáció) - mosás - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása - avidin-enzim konjugátum Az ELISPOT lemez egy lyukának felülnézete a képződött foltokkal kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol) A citokin termelő sejt helyét mutató folt

Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

blasztos transzformáció Sejtciklus a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció transzkripció kimutatása (RT-PCR) fehérjék kimutatása (Immunoassay) sejtszám változás meghatározása (CFSE) DNS mennyiség meghatározása (fluoreszcens DNS interkalátorok, 3H-timidin)

A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl. a DNS-be sztöhiometrikus módon interkalálódó fluoreszcens festékekkel (propidium jodid, PI) G0 M G2 DNS analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához) G1 G0 G1 s sejtszám s G2 M Ha egymáshoz tapad 2db G0/G1 sejt (pl. Az osztódás után, vagy a SLAM miatt  ), akkor a méréskor úgy látszanak mintha G2 –ben lenne egy sejt. Ez az artefaktum az ún. doublet-discrimination módszerrel kizárható. A sejt áthaladási idejét méri a lézeren: a dupla sejtnek kétszer annyi idő kell. Ez alapján kikapuzható. 2N 4N 200 400 600 800 1000 DNS mennyiség Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra)

A B-/T-sejt proliferáció mérésére alkalmas módszerek 3H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri. Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott (β-bomlás mérése). A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). Also perfect as a tracer of any injected cells in vivo Újabban a karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter (CFSE) használata terjedt el.

A sejtosztódás meghatározása A „Cell tracer” festékek bediffundálnak a sejtbe, és sokáig megőrződnek. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez. Amikor az intracelluláris festék a két utódsejtbe szétosztódik, a fluoreszcencia intenzitás felére csökken. sejtosztódások: 7 6 5 4 3 2 1 0 A karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter (CFSE) a kapcsolt acetát-észter csoporttól apoláros, így képes átjutni a lipidmembránon. A sejtben levő észterázok az acetát csoportot lehasítva csapdába ejtik, és a reaktív szukcinimidil csoport kovalensen kötődik az fellelhető amin csoportokhoz (pl. lizin oldalláncok).

T-sejtek funkcionális vizsgálata Antigén specifikus T-sejtek azonosítása Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral antigén specifikus T-sejt immunizálás Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak.

T-sejt Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható a specifikus T-sejt receptor kimutatására De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású MHC T-sejt receptorok egy MHC molekula és T-sejt receptor kölcsönhatása nem elég erős T-sejt

Pentamer (vagy tetramer) technika Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet. Pentamer (vagy tetramer) technika a létrejövő pentamer self assembling coiled-coil-domain MHC peptid fluoreszcens jelzés a pentamer egyik alegysége

T-sejt Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal nagy aviditású. MHC pentamer MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás eljárás hatékonysága. T-sejt receptorok peptid-specifikus T-sejt Ide kattints az animációhoz

CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek (a normál populáció 90-95%-a hordozó) Tetramer (pentamer) jelöléses példák A perzisztáló (pl. herpeszvírusok) vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T-sejtek száma viszonylag magas lehet CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban Influenza epitóp (GILGFVFTL/ HLA-A0201)-specifikus T-sejtek egészséges donorban CMV – cytomegalovírus (Herpesvírus, mint az EBV) nyálmirigyben, vesében egészséges személyben is egész életen át perzisztálhat

allél szekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredete A*0201 GVLVGVALI Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 694-702 LLGRNSFEV p53 261-269 LLLLTVLTV MUC-1 12-20 RLLQETELV HER-2/neu 689-697 RMFPNAPYL Wilm's Tumour (WT1) 126-134 SLLMWITQV NY-ESO-1 157-165 STAPPVHNV MUC-1 950-958 VISNDVCAQV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) 154-163 VLQELNVTV Leukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) 169-177 VLYRYGSFSV gp100 (pmel17) 476-485 YLEPGPVTA gp100 (pmel17) 280-288 YLSGANLNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 571-579 KVLEYVIKV MAGEA1 278-286 KVAELVHFL MAGEA3 112-120 KTWGQYWQV gp100 (pmel17) 154-162 HLSTAFARV G250 (renal cell carcinoma) 217-225 ILAKFLHWL Telomerase 540-548 ILHNGAYSL HER-2/neu 435-443 IMDQVPFSV gp100 (pmel17) 209-217 KIFGSLAFL HER-2/neu 348-356 LMLGEFLKL Survivin 96-104 ALQPGTALL Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) 14-22 CMTWNQMNL Wilm's Tumour (WT1) 235-243 ELAGIGILTV MelanA / MART 26-35 FLTPKKLQCV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) 141-150 GLYDGMEHL MAGEA-10 254-262 A*0301 KQSSKALQR bcr-abl 210 kD fusion protein 21-29 ATGFKQSSK bcr-abl 210 kD fusion protein 259-269 ALLAVGATK gp100 (pmel17) 17-25 A*2402 VYGFVRACL Telomerase reverse transcriptase (hTRT) 461-469 TYLPTNASL HER-2/neu 63-71 TYACFVSNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) 652-660 TFPDLESEF MAGEA3 97-105 EYLQLVFGI MAGEA2 156-164 AFLPWHRLF Tyrosinase 188-196 B*0801 GFKQSSKAL bcr-abl 210 kD fusion protein 19-27 Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid pentamer példák allél szekvencia EBV epitop A*0201 CLGGLLTMV EBV LMP-2 426-434 GLCTLVAML EBV BMLF-1 259-267 A*1101 IVTDFSVIK EBV EBNA-4 416-424 A*2402 TYGPVFMCL EBV LMP-2 419-427 B*0702 RPPIFIRRL EBV EBNA-3A 247-255 B*0801 FLRGRAYGL EBV EBNA-3A 193-201 RAKFKQLL EBV BZLF-1 190-197 B*3501 HPVGEADYFEY EBV EBNA-1 407-417 allél szekvencia Influenza A epitop A*0101 CTELKLSDY Influenza A (PR8) NP 44-52 A*0201 GILGFVFTL Influenza A MP 58-66 A*0301 ILRGSVAHK Influenza A (PR8) NP 265-274 allél szekvencia HIV epitop A*0201 ILKEPVHGV HIV-1 RT 476-484 KLTPLCVTL HIV-1 env gp120 90-98 SLYNTVATL HIV-1 gag p17 76-84 TLNAWVKVV HIV-1 gag p24 19-27 A*0301 QVPLRPMTYK HIV-1 nef 73-82 RLRPGGKKK HIV-1 gag p17 19-27 A*2402 RYLKDQQLL HIV-1 gag gp41 67-75 B*0702 IPRRIRQGL HIV-1 env gp120 848-856 TPGPGVRYPL HIV-1 nef 128-137 B*0801 FLKEKGGL HIV-1 nef 90-97 GEIYKRWII HIV-1 gag p24 261-269 B*2705 KRWIILGLNK HIV-1 gag p24 265-274 H-2Kd AMQMLKETI HIV-1 gag p24 199-207

Esettanulmány Helen Burns a család második gyermekeként született. 6 hónapos koráig normálisan fejlődött, ekkor azonban mindkét tüdőfélre kiterjedő tüdőgyulladás fejlődött ki nála, amelyet súlyos köhögés és láz kísért. A vérből és a köpetből készített baktériumtenyészetek negatívak voltak, a légcsőből nyert aspirátum azonban nagy mennyiségű Pneumocystis carinii jelenlétét mutatta ki. Pneumocystis elleni pentamidin kezelést követően állapota javult, majd teljesen felépült. Mivel a tüdőgyulladást az opportunista kórokozó, Pneumocystis carinii okozta, fennállt a gyanúja, hogy Helen súlyos kombinált immunhiányos betegségben szenved. Az eddig szerzett ismeretek alapján milyen vizsgálatokat lehetne elvégezni a betegség kizárása vagy igazolása érdekében?

Vérmintát vettek tőle, és perifériás mononukleáris sejtjeit fitohemagglutininnel (PHA) stimulálták, hogy [3H]-timidin DNS-be való beépülésének mérésével képet kapjanak a T-sejtek működéséről. A proliferációs T-sejt válasz normális volt, a [3H]-timidin beépülésének értéke 114 050 cpm volt (normális kontroll: 75 000 cpm). Helen megkapta a szokásos védőoltásokat, az orálisan adott poliovakcinát és kéthónapos korában a DPT- (diftéria, pertusszisz, tetanusz) vakcinát. További vizsgálatok során azonban T-sejtjei nem adtak választ a tetanusztoxinra in vitro, allogén B-sejtekkel való stimulációkor azonban a [3H]-timidin beépülési tesztben a válasz normális volt (6730 cpm, szemben a stimulálatlan a sejtekben mért 783 cpm-mel). Miután felismerték, hogy Helen T-sejtjei specifikus antigénstimulussal szemben válaszképtelenek, megmérték szérum-immunglobulinjainak a szintjét és azokat rendkívül alacsonynak találták: IgG szint: 96 mg/dl (normális: 600-1400 g/dl) IgA szint: 6 mg/dl (normális: 60-380 mg/dl) IgM szint: 30 mg/dl (normális: 40-345 mg/dl)

Helen fehérvérsejtszáma 20 000 sejt/μl volt, ami magas (normális érték: 4000-7000 μl). Ezekből 82 % volt neutrofil, 10 % limfocita, 6 % monocita és 2 % eozinofil. A fentiekből kiszámítható 2000 limfocita/ μl a korának megfelelő várható értékhez (> 3000 μl) hasonlítva alacsony volt. Limfocitáinak 7 %-a volt B-sejt (CD20+ ) (normális érték: 10-12 %), és 57 % reagált a CD3 T-sejt markerrel. A CD8+ T-sejtjeinek száma (388 sejt/μl) a normális határokon belül volt, a CD4+ T-sejtek száma azonban (228 sejt/μl) a normálisnál sokkal alacsonyabb volt (a normális érték általában a CD8+ T-sejtek számának a kétszerese). A T-sejtek viszonylag nagy száma, és a PHA-ra adott normális immunválasz kizárta a súlyos kombinált immunhiányos állapot (SCID) diagnózisát.

Helent gyermekorvosa a diagnózis hiányának ellenére beutalta a kórházba csontvelő-átültetés tervezése céljából. Amikor Helen, édesanyja, édesapja és egészséges 4 éves bátyja szövettipizálására került sor, Helen fehérvérsejtjeiből nem tudtak DR-típust meghatározni. B-sejtjeit in vitro Epstein-Barr vírussal transzformálták, hosszú távú tenyészet nyerése érdekében, s ezeken a sejteken fluoreszcensen jelölt antitestekkel vizsgálták az MHC-I és az MHC-II molekulák expresszióját. A vizsgálatok kimutatták, hogy B-sejtjein sem HLA-DQ, sem HLA-DR molekulák nem voltak, így megállapították az MHC-II hiánybetegség diagnózisát.

Összefoglalás és kérdések Mivel Helen testvérének HLA típusa eltérő volt, így az anyát választották csontvelődonornak. Az anyai csontvelőből - amelyet Helen transzfúzióval kapott - a graft versus host reakció megelőzése végett eltávolították a T-sejteket. Az átültetés sikeresnek bizonyult, s az immunfunkció helyreállt. Összefoglalás és kérdések 1. Miért nem voltak Helen vérében CD4 T-sejtek? A CD4+ T-sejtek érése a tímuszban a timociták és a tímusz epitélsejtein levő MHC-II molekulák közötti kölcsönhatástól függ. MHC-II gének genetikai deléciója egerekben szintén a CD4+ T-limfociták hiányát eredményezi. . Miért volt Helen vérében az immunglobulin-szint alacsony? A B-sejtek poliklonális expanziójához és immunglobulin-termelődő plazmasejtekké való éréséhez CD4+ T-sejtek által termelt citokinek, mint pl. IL-4 segítsége szükséges. Helen hipogammaglobulinémiája tehát a CD4+ T-limfociták hiányának a következménye.

SCID-ben a limfociták nem válaszolnak mitogénstimulációra SCID-ben a limfociták nem válaszolnak mitogénstimulációra. Bár először úgy gondolták, hogy Helen SCID-ben szenved, a diagnózist megcáfolta a PHA-ra és az allogénstimulációra adott normális válasza. Mi a magyarázata ennek a megfigyelésnek? Helen T-sejtjei kisebb számban vannak ugyan jelen, működésük azonban normális, a probléma ezeket a sejteket nem érinti. Nem specifikus mitogénekre és alloantigénekre, amelyek a normális allogén sejt felszínén levő MHC-molekulák, s így nincs szükség feldolgozásukra és a hibás sejtek általi prezentálásukra, képesek normális választ adni. Limfocitáinak tetanusztoxinra való in vitro válaszképtelensége viszont azzal magyarázható, hogy ebben az esetben nincsenek olyan sejtek jelen, amelyek az antigént prezentálni tudnák az MHC-II molekulákon a T-sejtek felé. 4. Amennyiben Helen alkarjára bőrgraftot ültetnének, kilökődne-e a transzplantátum? Igen. Helen T-sejtjei képesek lennének a transzplantátum sejtjein levő idegen MHC-molekulák felismerésére, s a graft kilökődne.