Az izomdystrophiák molekuláris genetikai vizsgálata Pikó H., Balog J. Herczegfalvi Á., Mayer P., Mechler F., Horváth R., Karcagi V. Fodor József Országos Közegészségügyi Központ Bethesda Gyermekkórház, DEOE Neurológiai Klinika, Hódmezővásárhelyi Kórház, Jahn-F. Dél-pesti Kórház

Izomdystrophiák Duchenne/Becker izomdystrophia (DMD/BMD) Facioscapulohumeralis izomdystrophia (FSHD)

Általános jellemzők, klinikai tünetek Előfordulási gyakoriság - DMD 1:3500, BMD 1:30000 X kromoszómához kötött recesszív öröklődésmenet A betegség kezdete 2 éves korra tehető, fokozatos progresszióval Az elhalálozás ideje 20-25 éves korban A Becker típus esetén enyhébbek a tünetek, nincs korai halál

A betegség genetikai háttere, pathomechanizmusa A dystrophin gén (Xp21) 2.5 Mb méretű, 79 exont tartalmaz és 14 kb méretű mRNS-t kódol A géntermék a dystrophin fehérje (427 kDa), amely sarcolemmális lokalizációt mutat a dystrophin- asszociált glycoprotein komplex részeként A DMD esetén a dystrophin teljes hiánya, BMD esetén csökkent mennyisége mutatható ki

A betegség kialakulásában szerepet játszó géndefektusok Deléciók (60%), hot-spot régiók a gén proximalis és distalis részén Duplikációk (5%) Pontmutációk (35%) Minden harmadik esetben új mutáció alakul ki A mutáció következményei (frame-shift hipotézis) „in-frame” mutáció - BMD fenotípus „out of frame” mutáció - DMD fenotípus

Molekuláris diagnosztikai vizsgálatok Multiplex PCR reakció – 2 x 9 exon vizsgálata egyidejüleg Southern blot analízis – cDNS próbákkal ( XJ10, 7b8, 30.2, 30.1, 47.4, 60.1) Immunohistochemia Western blot technika – fehérje analízis

Multiplex PCR deléciós analízis

Southern hibridizáció XJ10 cDNS próbával (HindIII és BglII emésztés)

Eredmények Eddig 100 betegnél végeztük el a multiplex PCR analízist, amely alapján a betegek 57%-ában deléciót mutattunk ki Négy esetben végeztünk prenatális vizsgálatot A feltételezett hordozó anyák és leánytestvérek (31 fő) cDNS vizsgálata során 18 esetben bizonyítottuk a hordozósági státuszt Az új módszerek bevezetése a DMD/BMD betegség molekuláris genetikai vizsgálatában lehetőséget biztosít az alábbi célok megvalósításához: deléciók méretének pontos meghatározása de novo mutációs esetek azonosítása hordozósági státusz vizsgálata prenatális vizsgálatok felajánlása

Az FSHD molekuláris háttére (1.) Öröklődésmenete autoszómális domináns, de nem teljes penetranciával (95%-os) A 4q és 10q kromoszómák szubtelomerikus régiójában található D4Z4 ismétlődő szekvenciák A betegekben a 4q35 régióban DNS átrendeződés történik, a D4Z4 szekvenciák száma csökken Eltérő restrikciós térkép: - a 4q35 régióban csak egy D4Z4 tartalmaz BlnI hasítási helyet - a 10q26 régióban minden egyes D4Z4 tartalmaz BlnI hasítási helyet

Az FSHD molekuláris háttére (2.) A p13E-11 polimorf próba detektálja EcoRI emésztés után: 4q35 38kb-300kb (egészséges), 10kb-38kb (beteg) 10q26 20kb-320kb Komplikáló tényező: szubtelomerikus kicserélődések a 4q35 és 10q26 régió között (a populáció 20%-ában) - PFGE alkalmazása ill. dózis teszt EcoRI fragmentum mérete korrelál a betegség súlyosságával és a tünetek megjelenésének időpontjával De novo mutációk is→ juvenilis formák

Southern analízis értékelése <38kb BlnI rezisztens fragmentum FSHD <38kb BlnI szenzitív fragmentum dózis teszt 10-es típusú repeatek túlsúlyban FSHD 4-es típusú nem FSHD repeatek túlsúlyban

Dózis analízis Southern hibridizációval

FSHD genotípus ikrekben Súlyos, infantilis típus, de novo mutációval, 1 D4Z4 repeat elem maradt 4q35: p13E-11 próbával a betegek EcoRI fragmentuma <38 kb, BlnI rez.

FSHD molekuláris vizsgálataink eredményei (2000.-2004.) Család 38 Eredmény Tünet-mentes Beteg Össz fő 78 pozitív - 32 55 negatív 18 9 23 folyamatban 5 14