Az RNS interferencia szerepe a génregulációban

1.Az RNS interferencia felfedezése: az RNS interferencia jelensége, felfedezése 2.miRNS: a miRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában 3.miRNS célpontok keresése állatokban

1. Az RNS interferencia felfedezése -2006: orvosi Nobel-díj Craig C. Mello, Andrew Fire -Kísérletek: C. elegans-on (fonálféreg) 1. az elcsendesíteni kívánt gén mRNS-ével egyszer azonos, másszor ellentétes szekvenciájú RNS bejuttatása → génelcsendesítés mindegyik esetben ha egyszerre juttatták be → erősebb génelcsendesítés 2. az állatokat genetikailag módosított baktériumokkal etették (az állat egyik génjének mRNS-ével azonos felépítésű duplaszálú mRNS-eket termelt) → úgy viselkedtek, mint akiknek nincs adott működőképes génjük (Nature: 1998-ban publikálták)

2. A mikroRNS-ek felfedezése, keletkezése, szerepe az RNS interferenciában Transzkripciós faktorok, miRNS-ek és azok születése sokfajta génszabályozás -transzkripciós faktorok: fehérjék, gátolják vagy aktiválják a transzkripciót kis cisz-regulációs elemekhez kötődnek - mikroRNS: érett mikroRNS: rövid, nemkódoló ssRNS-ek (egyszálú RNS), amelyek gátolják a mRNS-ek transzlációját kötődik a mRNS vele komplementer szakaszához (miRNS kötőhely) ≈70 nukleotidból álló hajtű struktúrából vágódik ki (pre-miRNS) a Dicer enzim vágja ki

pre-miRNS: a pri-miRNS-ből (primery miRNS) vágja ki a Drosha enzim pri-miRNS: a DNS-ből az RNS-polimeráz II. által átírt elsődleges miRNS átirat több száz nukleotid hosszúságú is lehet, több pre-miRNS-t tartalmazhat néha a fehérjekódoló gének intronjaiban vannak (a splicinggal vágódnak ki) Növényeknél a miRNS érés a sejtmagban történik.

Humán genom: 328 miRNS-t azonosítottak eddig nagyobb, mint 1%-a a géneknek miRNS-t kódol a fehérjekódoló gének több, mint 30%-áról hiszik azt, hogy miRNS-ek regulálják Arabidopsis: 199 miRNS

A miRNS-ek felfedezése ~22 nukleotid hosszú RNS-ek A mRNS-hez kötődnek, génelcsendesítés: → hasítás → transzlációs represszió 1993: Victor Ambros, Rosalind Lee, Rhonda Feinbaum Felfedezik, hogy a lin-4 C. elegans-ban található gén, ami a lárvafejlődés időzítéséért felelős nem fehérjét, hanem egy pár rövid RNS-t kódol Az egyik RNS ~22 nukleotid hosszú, a másik ~61 nukleotid hosszú A lin-4 RNS-eknek „antisense” (a mRNS átirat szálával komplementer) komplementaritásuk van több helyhez a lin-14-es gén 3’ UTR szakaszában → csökken a LIN-14 fehérje mennyisége anélkül, hogy a lin-14 mRNS mennyisége csökkenne  modell: a lin-4 RNS a lin-14 3’ UTR-jének egy szakaszával párt alkot, transzlációs repressziót végez (egy regulációs útvonal része, ami az első lárva állapotból a második lárva állapotba való átmenetet indítja el)

-2001: a rövidebbik lin-4 RNS a kicsi reguláló RNS-ek csoportjába tartozó RNS: miRNS -2003: miRNS funkciók eddig: sejtosztódás sejthalál zsír metabolizmus a legyekben neurális mintázatok kialakulása a nematodákban levél- és virágfejlődés a növényeknél

A., C.Elegans stem loop-ok a lin-4, let-7 esetében B., Példák állatokban található stem loop-okra (a mir-1, mir-34, mir-124 esetén) C., Három Arabidopsis stem loop (MIR165a, MIR172a2, JAW) piros: értett miRNS-ek kék: kísérleti úton megtalált szekvenciák

Növényi, állati miRNS -A növényekben a stem loop-okban lévő visszahajlások méret szempontjából sokkal változatosabbak, mint az állatokban -Növényekben nagyobb a komplementaritás a miRNS és a stem loop másik karja között, mint az állatokban -Növényekben keskenyebb méreteloszlás van a miRNS 21 nukleotidja körül, mint az állatoknál, itt nukleotid körül van az eloszlás

Reguláció RNS interferenciával RISC komplex - Miután létrejönnek a miRNS-ek (növényekben, állatokban, gombákban), siRNS-ek (állatokban), csak az egyik szál kerül bele egy ribonukleoprotein komplexbe ( RNA including scilencing complex): RISC Az elcsendesítendő mRNS-t olyan üzenetek alapján ismeri fel, ami a tökéletes, vagy majdnem tökéletes bázispárosodáson alapul - A RISC-en található endonukleáz hasítja a mRNS-t közel a komplementer szakasz közepéhez A RISC-et légy és emberi sejtekből izolálták - A miRNS-eket először a miRNP komplexben találták meg (miRNA ribonukleoprotein komplex) ugyanazokkal a speciális tulajdonságokkal rendelkezik, mint a RISC, lehet, hogy a RISC egy altípusa - Amikor a miRNS:miRNS* duplexből a miRNS bekerül a RISC komplexbe, akkor a miRNS* degradálódik A duplexnek az a szála kerül be a komplexbe, amelyiknek az 5’ végénél lazább a bázispárosodás

mRNS hasítás, transzláció represszió Hasítás -Ha a mRNS és a miRNS komplementaritása megfelelő, akkor hasítás Transzlációs represszió -Ha nincs megfelelő komplementaritás ahhoz, hogy hasítson → elnyomja a transzlációt Jelenség: A lin-4 RNS-ek expressziójával korreláltan csökken a LIN-14 fehérje mennyisége, eközben a mRNS-ek száma nem változik A lin-14 mRNS poliszóma profilja az első lárvaállapotban megkülönböztethetetlen a későbbi lárvaállapotokétól, amelyekben már a LIN-14 fehérje mennyisége csökkent

Két lehetséges magyarázat: 1.lin-4 RNS a transzlációs iniciáció után elnyomja a transzlációt úgy, hogy nem változtatja meg a riboszómák sűrűségét az üzeneten (pl. riboszómák lassítása vagy megállítása) 2A transzláció ugyanúgy folytatódik tovább, de az új szintetizálódó polipeptid specifikusan degradálódik Néhány megjegyzés: -Jelentős komplementaritás kell a hasításhoz -Az állatoknál kisebb mértékű a komplementaritás, mint a növények esetében → az állatoknál jelentősebb a transzlációs represszió, mint a növényeknél -Több RISC komplex hatására történik hatásos transzláció inhibíció, ezért is jó, ha több miRNS komplementer hely van a mRNS-en (állatoknál) -Néhány miRNS a DNS transzkripciós csendesítését is végezheti

A., mRNS hasítás B., transzlációs represszió C., transzkripciós génelcsendesítés

3. miRNS célpontok keresése állatokban Korai szakasz: - (2003) egy légy miRNS (bantam) negatívan regulálja a pro-apoptotikus hid gént hid gén → híd fehérje: elősegíti az apoptózist (gátolja az apoptózist gátló faktort (IAP), így teszi lehetővé, hogy bekövetkezzen az apoptózis) - a Drosophila, gerincesek esetében sok más miRNS célpont-jóslás a következők alapján: 1. kevés kísérletileg azonosított valószínűsíthető célponthoz való kapcsolódási hely (20 kapcsolódási hely 2 miRNS-re Drosophilában) 2. Megfigyelés: az ismert poszttranszkripciós regulációs motívumok a 3’ UTR- ben teljes mértékben komplementerei néhány légy miRNS 5’ végének 3. in vitro kísérletek eredménye: több kapcsolódási hely a 3’ UTR-ben exponenciálisan megnöveli a mRNS elcsendesítésének mértékét Ezek az eljárások nem csak a komplementaritás alapján értékelték a miRNS-mRNS párokat, hanem a kapcsolódáskor érvényes szabadenergiára is. (scoring)

-kiderült: 6-8 bp hosszú szakaszok, amelyeknél tökéletes Watson-Crick bázispárok alakulnak ki a miRNS-mRNS között → ezek segítettek a legtöbbet a szabályozott mRNS-ek megtalálásában általában a miRNS 5’ végén helyezkednek el (seed site) A 6-8 bp hosszú tökéletes W-C bázispárokból álló szakaszokat nukleusznak szokták nevezni -A létrejött nukleusz, (legyőzve a hőmozgást) a két szál gyors összecipzározódását segíti elő majd a mRNS-miRNS duplexben bázispárok kialakulásával termodinamikailag stabilizálódik a rendszer -Az algoritmusok kapcsán felmerülő szempontok, nehézségek Állati miRNS-ek esetén a kapcsolódási hely kicsi, ezért korlátozott a komplementaritása → ha kis eltérés van az algoritmusban, nagy eltérés lehet a célpontmeghatározásban általában az algoritmusok az evolúciós szempontból konzervált kapcsolódási helyeket tekintik biológiailag fontosnak célpont-meghatározás szempontjából

különböznek az eljárások a következőkben: a kapcsolódási helyek konzerváltságának mértékét máshogy határozzák meg (scoring szabályai) az ortológ 3’ UTR szekvenciát hogyan definiálják, hogyan vizsgálják probléma: hogyan vegyék figyelembe a 3’ UTR szekvencia hosszát → rövidebb 3’ UTR- ben lévő kapcsolódási hely hatékonyabban vagy kevésbé hatékonyan csndesíti a mRNS-t (hogyan számítsuk bele a score-ba)

Célpont-meghatározás ma: -Kapcsolódási hely mutációs kísérleteken és az azt követő bioinformatikai analízisen alapul (gyakran felhasználják a fajok összehasonlításából kapott eredményeket) a mutációs kísérletek megmutták: kétfajta célpont létezik 1. Tökéletes W-C bázispárok kialakulása a miRNS 5’ végének ‘seed’ szakaszához 2. Nem tökéletes illeszkedés az 5’ végen lévő szakaszhoz, további bázispárok alakulnak ki a miRNS 3’ végénél -Az első csoportba tartozó kapcsolódási helyek száma egy nagyságrenddel nagyobb, mint a második csoportba tartozók száma

a., Az első csoporthoz tartozó és a b., a második csoporthoz tartozó miRNS-ek kapcsolódása a mRNS-hez

Az algoritmusok összehasonlítása: -~ 130 kísérletileg meghatározott mRNS-miRNS (Drosophila) alapján értékelték az algoritmusokat (Cohen Laboratory, EMBL) -A legjobban szereplő két algoritmus: PicTar, EMBL: 90%-os pontosság (annak a valószínűsége, hogy az algoritmus konzisztens a kísérlettel) 70-80% érzékenység (mennyire képes az algoritmus tényleges mRNS-miRNS párokat találni) A többi algoritmus nem ért el ilyen érzékenységet és pontosságot, de sok más célpontot is megtalált

mRNS-miRNS párok: (példák) miRanda miRBase PicTar TargetScan, TargetScanS RNA hybrid mRNS-miRNS párokat kereső eszközök: RNAhybrid DIANA-MicroT RNA22 mRNS-miRNS párok kísérletileg alátámasztott adatbázisa: Tarbase Argonaute miRNAMAP

##txt Format ##source-version miRanda 3.0 ##created on: ##GROUP SEQ METHOD FEATURE CHR START END STRAND PHASE SCORE PVALUE_OG TRANSCRIPT_ID EXTERNAL_NAME Similarity cel-miR-785 miRanda miRNA_target III e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-796 miRanda miRNA_target III e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III e-02 Y39A3CL.4c Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-236 miRanda miRNA_target III e-02 Y39A3CL.4a Y39A3CL.4 Similarity cel-miR-260 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-262 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-36 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-37 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.4 Y46E12A.4 Similarity cel-miR-787 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.2 Y46E12A.2 Similarity cel-miR-72 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-60 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III e-03 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-266 miRanda miRNA_target III e-02 Y46E12A.3 Y46E12A.3 Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.1 ser-4 Similarity cel-miR-51 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-52 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-53 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-54 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-271 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-55 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-56 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-273 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-38 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.13.2 ser-4 Similarity cel-miR-239b miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-269 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-73 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 Similarity cel-miR-74 miRanda miRNA_target III e-02 Y22D7AR.12 Y22D7AR.12 C. elegans miRNA-ek és célpontok

Irodalom: Cell David P. Bartel: MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function Nature Genetics Nikolaus Rajewsky: microRNA target predictions in animals