Készítette: Füleki Lilla Az izocitrát-dehidrogenáz (ICDH) és az izocitrát-liáz (ICL) hatása a carbon fluxus szétválasztására az izocitrát csomópontnál E. coli acetáton történő növekedése esetén (esettanulmány) Készítette: Füleki Lilla

Miről is lesz szó? Acetáton való növekedése során az E. colinak szüksége van a glioxalát ciklusra is kiegészítőként bioszintetikus prekurzorok előállítására. Közvetlen verseny a glioxalát-ciklus izocitrát enzime (ICL) és a Krebs-ciklus izocitrát dehidrogenáz enzime (ICDH) között. Izocitrátra: affinitásICDH > affinitásICL, de: magas intracelluláris izocitrát koncentráció+az ICDH részleges inaktiválásáva az ICL-nek és MS-nak (malát-szintetáz) kedvez (bár nem találták még meg azt az in vivo szignált, ami felerősíti a glioxalát utat, és az is biztos, hogy nem az acetát az (El-Mansi 1998).

V1 V7 V6 V8 V2 V5 V4 V3

Walsh és Koshland (1984): mennyiségileg meghatározta a két ág carbon fluxus arányát az izocitrát csomópontnál (radioaktívan jelölt izotópos vizsgálat+NMR spektroszkópia) Cél: ICDH, ICL, (MS) enzimek relatív hozzájárulásának meghatározása a carbon fluxus átlagos elosztáshoz a kp-i metabolizmus különböző enzimei között. MetaModel szoftvercsomaggal meghatározták: -steady-state fluxusokat és a különböző metabolitok koncentrációit -elasztikus koefficiensek mátrixát -kontroll és válasz koefficiensek különböző steady-state-ek alatt Adatok elemzése: Kacser’s MCA teóriája és a sebességmeghatározó lépés koncepció alapján.

A modell MetaModel 2.1 (Cornish-Bowden és Hofmeyr 1991) szoftver: az összes változó változását képes mérni és szimulálni; és ennek alapján kalkulálni a fluxus, metabolit koncentráció és koefficiens változásokat. A metabolit koncentráció változásokat differenciál egyenletek írják le: -Összesen 8 különböző reakció: ezek közül a 6. és a 7. átalakulási sebességei az ICL és MS lineáris kapcsolata miatt azonosak. -Steady-state állapotban a változás mértéke minden metabolitnál 0, azaz a képződési sebesség nettó értéke megegyezik a fogyasztás ütemével. -A ciklusban vannak ún. metabolit-poolok: melyek 3 különböző reakcióban is részt vehetnek.

A skeleton modell egyensúlyi egyenletei Flux kapcsolatok 0=V1-V2-V6 (izocitrát) >V1=V2+V6 0= V2-V4-V3 (L-ketoglutarát) >V2=V3+V4 >V3=V2-V4 0= V4+V6-V5 (szukcinát) >V5=V4+V6 >V4=V5-V6 0=V6-V7 (glioxalát) >V6=V7 0=V5+V7-V8-V1 (oxál acetát) >V1+V8=V5+V7 >V8=V5-V2

v=(VfS/Ks-VrP/Kp)/(1+S/Ks+P/Kp) Az enzimatikus reakciók felírásának alapjául egy Michaelis-Menten típusú egyenlet szolgált: v=(VfS/Ks-VrP/Kp)/(1+S/Ks+P/Kp) ahol: Vf és Vr : Vmax értékek az oda- és visszafelé játszódó reakciókban S: szubsztrát P: termék Ks, Kp: Michaelis-Menten konstansok (vagyis adott metabolitra vett Km értékek)

Az egyenletek végigkövetik a változás mértékét és az összes szubsztrát koncentráció változását az acetil-CoA belépését követően. Figyelembe veszik az ICDH és ICL eltérő aktivitását. Walsh és Koshland (1984): az ICDH reverzibilis inaktiválása a fluxus 1/3-nak az ICL-on keresztüli áramlását eredményezi (vagyis 2,6:1-hez az ICDH javára) ezért 0,388 a modellben az ICL(E6) koncentráció, míg a többi enzimé 1. Illetve az acetil-KoA, glutamát és a PEP (mint “külső” metabolitok) intracelluláris koncentrációi: 56; 1,06; 1,69 mM-nak lettek rögzítve ezek mutatják, hogy az E. coli 1 gramm biomassza szárazanyag bioszintéziséhez ilyen bemeneti acetil-KoA és ilyen kimeneti glutmát és oxálacetát mennyiség szükséges (El-Mansi és mtsai 1994).

Enzim Sebesség Metabolitok (mM) [E1]=1,0000 1,1117 [x]=56,0000 (Ac-KoA input) rögzített [E2] =1,0000 0,8008 [OAA]=0,2236 változó [E3] =1,0000 0,0468 [ISO]=0,1174 [E4] =1,0000 0,7540 [KET]=0,1551 [E5] =1,0000 1,0469 [Y]=1,0600 (GLU output) [E6]=0,3880 (ICL) 0,3109 [SUC]=0,3880 [E7] =1,0000 [GLY]=0,0322 [E8] =1,0000 0,2642 [Z]=1,6900 (PEP output) (A sebességek mmolelfogyasztott szubsztrát /perc/ 10 ml sejttérfogat-ban kifejezve.)

1. X (acetil- KoA)+OAA=ISO V/[E1]=(5,1. X. OAA- ISO)/(1+X+OAA+ISO) 2 1. X (acetil- KoA)+OAA=ISO V/[E1]=(5,1*X*OAA- ISO)/(1+X+OAA+ISO) 2. ISO=KET V/[E2]=(10*ISO- KET)/(1+ISO+KET) 3. KET=Y (glutamát) V/[E3]=(7,5*KET- Y)/(1+KET+Y) 4. KET=SUC V/[E4]=(10*KET- SUC)/(1+KET+SUC) 5. SUC=OAA V/[E5]=(5*SUC- OAA)/(1+SUC+OAA) 6. ISO=GLY+SUC V/[E6]=(10,6*ISO- SUC*GLY)/(1+ISO+SUC+GLY) 7. GLY+X=OAA V/[E7]=(10*X*GLY- OAA)/(1+X+GLY+OAA) 8. OAA=Z (glükoneogenezis+bioszintézi s) V/[E8]=(11*OAA- Z)/(1+OAA+Z)

Eredmények I. 7.5 ábra: Ahogy az ICDH-n keresztüli carbon fluxus lecsökkent az izocitrát intracelluláris koncentrációja megemelkedett olyan szintre, ami fenntartja az ICL-n keresztüli fluxust (annak gyengébb affinitása ellenére). A további adatok azt mutatták, hogy bármilyen csökkenés az ICDH koncentrációjában a carbon fluxus ICL-en (és MS-en) keresztüli megnövekedését eredményezi. Ez feltölti elsődleges köztitermékekkel és bioszintetikus prekurzorokkal a központi anyagcsereutat.

Az ICDH-n keresztüli fluxus hatással van a központi anyagcsere út többi enzimjére is: Az összegzési tétel alapján (Kacser és Burns 1973) az enzimek fluxus kontroll koefficienseinek összege (JICDH-ra) 1. Ismétlés: fluxus kontroll koefficiens: adott anyagcsereút adott enzimén keresztüli fluxus relatív változásának mértéke válaszul az enzim (saját)koncentrációjának kis mértékű változására. elaszticitás koefficiens: a szubsztrát vagy az adott ko-faktor koncentrációjának kis mértékű változásából adódó relatív fluxus változás mértéke.

ICDH ICL MS ICDH ICL MS

A fluxus kontroll koefficiens: -Rendszerjellemző -Értéke nem teljesen független az anyagcsereút többi enzimétől. -A többi enzim fluxus kontroll koefficiens értékeivel való kapcsolatot az összegző tétel adja meg. -Az elaszticitási koefficienssel való kapcsolatát a konnektivitási tétel írja le ami figyelembe veszi a kinetikai tulajdonságait az összes anyagcsereútban résztvevő enzimnek. Válasz koefficiens: a externális effektorok hatása a metabolikus fluxusra. Nagy mértékben függ az enzim elaszticitási és a fluxus kontroll koefficienseitől (az effektorra vonatkozóan). Hogy az effektor a fluxusra hatni tudjon, ezen értékeknek elég magasnak kell lennie.

Eredmények II. 7.4, 7.5, 7.6 ábrák: Az ICDH koncentrációjának 1 fölötti növekedése már sem az enzimen keresztüli fluxust, sem az enzim fluxus kontroll koefficiensét nem növeli. Másrészt bármilyen csökkenés a ICDH intracelluláris aktivitásában jelentős hatással van az enzim carbon fluxusára és fluxus kontroll koefficiensére. Vagyis: ha az ICDH aktivitását 20%-ra, vagy annál kisebbre csökkentjük, az ICDH fluxus kontroll koefficiense növekszik (és ez az enzim carbon fluxusában is látszódik). Tehát az ICDH-n keresztüli fluxus acetáton való növekedéskor meghaladja a celluláris igényeket, így nem lehet sebesség- meghatározó.

7.7 ábra ICL aktivitásának közvetlen változtatása az enzimkoncentráció szisztematikus növelésével egy bizonyos küszöbértéket elérve a 2 ciklus összehangoltan működik, és többé nem gond a fluxus megoszlása ICL és ICDH között. Ha növeljük ICL koncentrációját: az ICDH-n és az ICL-n keresztüli fluxus is nőni kezd az intracelluláris izocitrát koncentráció rovására (ami csak 0,271 mM-ig emelkedik). Ha 100-ra növeljük az ICL koncentrációt: ICDH-n keresztüli carbon fluxus 115 mmol/min, ICL pedig 378 mmol/min-re emelkedik.

Összefoglalás: Az ICDH koncentráció növelése egy vad-típusban megfigyelt küszöbérték felett nem jár együtt ICDH-n keresztüli fluxus növekedéssel sem önmagában, sem az egész központi anyagcsereút esetén. Csak az izocitrát pool kimerülését okozza, és így csökkenti a glioxalát úton keresztüli fluxust. Általánosságban: Egyetlenegy enzim aktivitásának fokozása/koncentráció növelése nem megfelelő megoldás arra, hogy egy adott anyagcsereutat felerősítsünk, produktivitását növeljük.(De ez nem vonatkozik katalitikus aktivitás csökkentésre!)

Egy, az anyagcsereútban minden enzimet aktiváló effektor koncentrációjának növelése észlelhető növekedés okoz a fluxusban (és a hozamban) főleg akkor, ha az érintett enzimek relatív magas fluxus kontroll koefficienssel rendelkeznek. E. coli acetáton való növekedése során az ICL-n keresztüli fluxus esszenciális. (nem csak kipótolja a központi anyagcsereutat prekurzorokkal, hanem fenntartja a magas intracelluláris izocitrát koncentrációt) Egy bizonyos ICL koncentráció küszöbérték felett a Krebs ciklus és a glioxalát mellékút összehangoltan működik.

Kérdések: Mi az ICDH, ICL és az MS? Milyen kapcsolat áll fent az ICDH és az ICL között? Mi az a MetaModel? Az enzimatikus reakciók felírásának alapjául szolgáló Michaelis-Menten típusú egyenlet Mi történik, ha növeljük az ICL aktivitását? Mi a következménye az ICDH koncentráció emelésének? Mit mutat meg az elaszticitási koefficiens és a fluxus kontroll koefficiens? Mitől függ a válasz koefficiens értéke, és hogyan? Mi történik, ha ICDH aktivitását 20%-ra, illetve az alá visszük? Hogyan hat egy effektor a hozamra? Mit állapíthatunk meg végeredményben az ICL-en keresztüli fluxusról, illetve a glioxalát anyagcsereútról?

Köszönöm a figyelmet!