Állati sejtkultúrák alkalmazása a biotechnológiában Előadó: Madár Zsuzsanna

Bevezető ▪ a technológiának gazdag hagyományai vannak ▪ vakcina gyártás (állati és emberi) ▪ állati szövetek felhasználása rekombináns fehérjék előállítására (humán inzulin, növekedési hormon), kínai hörcsög petefészek és kölyök hörcsög vese sejtvonalakat használnak ▪ monoklonális ellenanyag termeltetésére (hybridoma technika: ellenanyagot termelő limfocita és tumorsejt fúziójával létrehozott sejt) ▪ Az állati szövetek tenyésztésével feltárhatók az állati sejtekre jellemző biokémiai utak és a sejtszintű szabályozás

Állati sejtek és a bioreaktor technológia ▪ az állati sejt tenyésztés alapvetően különbözik a mikrobiális fermentációtól: az állati sejtek törékenyek (nem rendelkeznek sejtfallal), nagyobb méret ▪ az első lépes a megfelelő állati sejtvonalak kiválasztása (önállóan osztódni képes: kötőszövet, hámsejtek, immunsejtek, tumorsejtek, idegsejtek) ▪ a sejtvonalak életfeltételeinek meghatározása (növekedési forma: szabadon a szuszpenzióban vagy hordozóhoz kötve, kinetika, termékstabilitás, érzékenység mechanikai hatásokra, oxigénigény) ▪ a tradicionális fermentációs ipar tapasztalataira támaszkodnak: megbízható, jól leírt, a méretnövelés megoldott

Levegőztetés ▪ O2 igény kisebb (századrésze a mikroba fermentációéhoz képest) ▪ méretnövelésnél azonban korlátozó tényező lehet az O2 ellátás ▪ a levegőztetésnél figyelembe kell venni bizonyos sejtek nyírásérzékenységét ▪ levegőztetési módszerek: • felületi levegőztetés (önmagában nem elegendő) • levegő átbuborékoltatása (nagyon hatásos, de károsíthatja a sejteket), néha tiszta O2-t használnak • membrándiffúzió → O2 –diffúzió egy szilikoncsövön keresztül

Habképződés ▪a habképződés különösen nagy problémát jelent az állati szérumot is tartalmazó tápközegek esetében, ha ezek a sejtek érintkeznek a habbal, valószínűleg elpusztulnak ( a hab károsíthatja a fehérjetermékeket is) ▪ habzásgátlók: nem alkalmazzák (nem bizonyított az állati sejttenyészetek esetében a hatékonyságuk) ▪ nem ionos felületaktív anyag (PLURONIC® F68): elterjedten alkalmazzák

pH-kontroll ▪ a pH a sejtek jólétének egyik legfontosabb paramétere ▪ a legelterjedtebb pufferrendszer: bikarbonát-CO2 ▪ pH csökkentése: steril CO2 befúvása (közvetlenül a tápközegbe, nyírásérzékeny sejtek esetén a reaktor fejébe nyomják és onnan diffundál a táptalajba) ▪ pH növelése: Na-bikarbonát vagy Na-hidroxid hozzáadása ▪ nagy méretekben könnyebben szabályozható ▪ a pH szabályozás általában automatizált

Hőmérséklet ▪ szűk határok között kell tartanunk (aranyhörcsög sejtek esetében 37°C) ▪ hőmérséklet-ingadozás: maximum ±0,5°C (de az automatikus hőmérséklet-szabályozók ennél precízebben tudják tartani a szükséges hőmérsékletet) ▪ az alacsonyabb hőmérsékletet elviselik az állati sejtek ▪ de a magasabb hőmérséklet sejtkárosodáshoz, vagy a sejtek pusztulásához vezet jegyzet

Sterilizálás ▪ az állati sejtek tenyésztésekor a lassú szaporodás miatt nagyon fontos a sterilitás, mivel a mikroorganizmusok és vírusok gyors szaporodási képességük miatt, igen hamar túlnövik a tenyészetet ▪ a sterilizálás legfontosabb lépése: megelőző kezelések, intézkedések (szelepek, zaróelemek ellenőrzése) ▪ de a készülék üzembehelyezését megelőzi egy nyomás ellenőrzés gőzzel (gyakorlatilag sterilizálás is) ▪ a helyes sterilizálás minden kiegészítő eszközre kiterjed ▪ karbantartás ▪ a táptalaj hővel nem sterilezhető, ezért a fertőzések elkerülése érdekében a táptalajba antibiotikumot tesznek

Víz és gőz előállítása ▪ a legegyszerűbb, de legkritikusabb alkotó ▪ bakteriális endotoxinok forrása ▪ standard víztisztító rendszerek: szénszűrő, ioncsere ▪ RO vagy desztilláció? ▪ a vizet használják tápközeg előállításához, az eszközök öbítéséhez, a gőzt sterilizáláshoz → megfelelő tisztaságú vízre van szükség ▪ WFI (Water For Injection) minőségű víz ▪ minőségi kontroll (folyamatos, „menetrendszerű” ellenőrzés a szúrópróbaszerűvel szemben; mikrobiális szennyezés, vezetőképesség, pH ellenőrzések, kémiai próbák)

Tápközeg készítés ▪ természetes közeget kell reprodukálni a tenyésztés során → komplex összetétel ▪ vérszérum (tartalmazza a komplex növekedést serkentő és gátló faktorokat, transzport fehérjéket) nélkül a legtöbb sejtvonal elpusztul, de veszélyforrás: vírusfertőzés ▪ szérummentes táptalaj előnyei: olcsó, állandó összetétel, kisebb a fertőzés-beviteli rizikó ▪ alkotók: figyelni kell a sterilitásra jó minőségű víz, aminosavak (glükóz-glutaminsav), lipidforrások (egyenes láncú zsírsavak, koleszterin), antibiotikumok, szervetlen sók (ionösszetétel, ozmózisnyomás), bikarbonát-CO2 puffer rendszer, koenzimek ? Porított alaptáptalaj, növekedési faktorok

Állati sejtek fermentációjával előállított termékek kibocsátásának szabályozása ▪ Center of Biologics Evaluation and Research (CBER) ▪ többek között ezeket szabályozzák: • engedélyezett termék gyártásával kapcsolatos irányelvek • sejtvonalak • tesztek, melyek garantálják a szennyezésektől mentes biológiai termékeket ▪ ha valaki gyártani és értékesíteni akar egy terméket, akkor annak gyártási technológiáját a CBER-nek jóvá kell hagynia

A jövő ▪ gyógyszeripari biotechnológiában a „jövő”: az állati sejtvonalak kiválóan alkalmazhatók a különböző rákellenes szerek, illetve gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálatára (állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése)

Köszönöm a figyelmet!