Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Scholtz Beáta Molekuláris Terápiák – 1. előadás

TÁMOP /1/A DEFINÍCIÓK 1.2 A BETEGSÉGEKRŐL 1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI A génexpresszió szabályozásának alapesetei Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért Genetikai aberrációk és betegségek Genom microarray-k Array összehasonlító genom hibridizáció (aCGH) A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány fejlődéséhez. FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.

4 Definíciók Genomika: a genomok, azaz az élőlények DNS állományának vizsgálata, bioinformatikai eszközökkel. Előfeltétele: genomszekvenciák adatbázisokban. Statikus: a genomszekvenciák elvileg nem (igen lassan) változnak. Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával. Funkcionális genomika: Genotípus és fenotípus korrelációk. Globális, nagy áteresztő-képességű módszerek segítségével vizsgálni a gének és termékeik funkcióit. Normál és patológiás állapotokban A környezeti változások hatására Különböző élőlények összehasonlítása TÁMOP /1/A

5 Mi a funkcionális genomika? Funkcionális genomika: Globális (genom-szintű vagy rendszer-szintű) kísérleti módszerek kifejlesztése és alkalmazása, melyek a strukturális genomika reagenseivel és információival együtt alkalmas a gének funkcióinak vizsgálatára. Jellemzően nagy áteresztő-képességű, sok mintát vizsgáló kísérletes megközelítéseket jelent, melyeket az eredmények számítógépes, statisztikai analízise egészít ki (Hieter and Boguski 1997). A fenotípus vizsgálatra használt funkcionális genomika elsősorban abban különbözik a klasszikus módszerektől, hogy lényegesen több mintát/adatpontot vizsgál, és erősen automatizált. Egy klasszikus génexpressziós kísérlet azt vizsgálhatja, hogy hogyan változik egy gén aktivitása az egyedfejlődés során in vivo. Modern funkcionális genomikai megközelítéssel ezzel szemben azt vizsgáljuk, hogy hogyan változik gének ezreinek-tízezreinek az aktivitása az egyedfejlődés során. (UCDavis Genome Center) TÁMOP /1/A

6 A genetikai variációk teszik lehetővé az evolúció motorjaként szolgáló adaptív változásokat. Bizonyos változások javítják a faj alkalmazkodó-képességét. Mások káros hatásúak. A faj bizonyos egyedei számára a káros változatok betegséget okozhatnak. Molekuláris szemszögből: mutáció és variáció Orvosi szemszögből: patológiás állapot Emberi betegségek: a változatok következményei J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

7 A genom sok régióját érintheti Sokféle mutációs mechanizmus létezik A gének és termékeik kölcsönhatásban vannak a molekuláris környezetükkel Az egyén olyan kölcsönhatásba kerülhet környezetével, ami elősegíti a betegség kialakulását Miért van olyan sokféle betegség? J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

8 Orvoslás: diagnózis, kezelés, prognózis, megelőzés Genetika: megérteni az egyedi fenotípus hátterét és kialakulását Genomika/funkcionális genomika: gének azonosítása és karakterizálása. Kromoszomális elrendeződésük, betegségekben betöltött szerepük és funkcióik Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával. Egy betegség különböző perspektívákból J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

9 Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával. A DNS adatbázisokban tárolt referencia szekvenciák a normál és betegséggel kapcsolható szekvenciák összehasonlítására is használhatók A fizikai és genetikai térkép betegség-gének azonosítására alkalmas A proteinek szerkezetét vizsgáló kísérletek értelmezhetik a mutációk hatásait A géneket többféle funkcionális genomikai módszerrel tanulmányozzák A betegségekkel kapcsolt génekről sok minden megállapítható az ortológ gének és funkcióik összehasonlításával Egy betegség a bioinformatika szemszögéből J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

10 Négy alapvető betegségtípus: A betegségek alaptípusai Monogénes komplex genomikai környezeti J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

11 Egygénes betegségek ritkatöbbgénes patofiziológia autoszomális domináns autoszomális recesszív X-kapcsolt recesszív Komplex betegségekgyakori többgénes központi idegrendszer kardiovaszkuláris veleszületett rendellenességek Kromoszóma elváltozásokgyakori többgénes Fertőző betegségekleggyakoribbtöbbgénes Környezet okozta betegségek leggyakoribbtöbbgénes A betegségek alaptípusai TÁMOP /1/A

12 Korábban szigorúan elválasztották egymástól az egygénes és a többgénes (komplex) betegségeket. Ma már inkább átfedőnek látjuk őket. Az egygénes betegségeket definiálhatjuk úgy, hogy a rendellenességet elsősorban egy gén mutációi váltják ki. Ettől függetlenül, a patofiziológia kialakításában több gén is részt fog venni. Egygénes betegségek J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

13 Betegségek alaptípusai: Komplex betegségek Az egygénes betegségek 90%-a serdülőkorra manifesztálódik 1%-uk 50 éves kor fölött jelentkezik A komplex betegségek jellemzően később jelentkeznek Ha korán jelentkeznek, a tünetek lényegesen súlyosabbak Példák: fejlődési rendellenességek, korai asztma, magas vérnyomás, rák, cukorbetegség A komplex betegségek fenotípusa gradiens mentén változik a populációban J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

14 Komplex betegségek Több gén felelős a kialakulásukért. A génekben található mutációk vagy szekvencia variánsok együttes kombinációja határozza meg a betegséget. A komplex betegségek nem mutatnak Mendeli öröklődést: családokban halmozottan fordulhatnak elő, de nem szegregálódnak. Ezért a szokásos genetikai analízisekkel (pl. linkage) nem könnyű azonosítani az érintett géneket még a családok ismeretében sem. A hajlamosító allélek gyakoriak a populációban. Komplex betegségek például: asztma, autizmus, magas vérnyomás, elhízás, csontritkulás. J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

15 Genomi - kromoszomális - betegségek Sok betegség hátterében kromoszomális deléciók, duplikációk vagy átrendeződések állnak. Előfordulhat aneuploidia is, azaz a normálistól eltérő kromoszómaszám. Ezeket a betegségeket bioinformatikai szempontból genomi microarray kísérletekkel érdemes tanulmányozni. J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

16 J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

17 Duchenne izomdisztrófia (1986) Cisztikus fibrózis (1989) Huntington betegség (1993) BRCA1 és 2 - emlőrák (1994) Fizikai térképezéssel azonosított betegséggének J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

18 Autoszómás domináns BRCA1, BRCA2 1:1000 Huntington chorea1:2,500 Tuberous sclerosis1:15,000 Autosomal recessive Albinizmus1:10,000 Sarlósejtes anémia1:655 (U.S. fekete) Cisztikus fibrózis1:2,500 (Európa) Fenilketonuria1:12,000 X-kapcsolt Hemofília A1:10,000 (férfiak) Rett szindróma1:10,000 (nők) Törékeny X szindróma1:1,250 (férfiak) Egygénes betegségek J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

19 Példa: Az ólommérgezés környezet okozta betegségnek tekinthető. Elég gyakori - az USA-ban élő gyermekek 9%-ában magas a vér ólomszintje. De ugyanolyan ólomterhelésnek kitett gyermekek fenotípusa egészen különböző lehet. A különbséget az eltérő genetikai háttér okozza. Következtetés: a genetikai háttér befolyásolja a környezeti tényezők vagy fertőző ágensek hatására kialakuló betegségek manifesztációját. Még egygénes betegségeknél is több gén megváltozott működése alakítja ki a végső fenotípust. Betegségtípusok: környezet okozta betegségek J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

20 Mitokondriumok: Több mint 100 betegség-okozó mutáció ismert Peroxiszómák: A mutációk vagy a peroxiszóma funkciót, vagy az organellum biogenezisét érintik. Élesztőben jól modellezhetők. Lizoszómák Egyéb betegségtípusok: az organellumok betegségei J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

21 A humán mitokondriális genom morbiditási térképe DiMauro and Schon, 2001 TÁMOP /1/A

22 TÁMOP /1/A

23 A betegségmechanizmusok feltárásának módszerei Egygénes betegségek: Genetika és genomika Módszerek: linkage analízis, genom-szintű asszociációs vizsgálatok, kromoszóma aberrációk azonosítása, genom DNS szekvenálás Többgének betegségek: genomika, funkcionális genomika, genetika stb. A globális analízisek azonosíthatják a molekuláris terápia célpontjait! 1.Betegségokozó gének: (kardiovaszkuláris, diabétesz, Alzheimer-kór) 2.Gének és a környezet közötti interakciók, melyek krónikus betegségekhez vezethetnek 3.A rák különböző aspektusai terápiás válasz prognózis kiújulás 4. Alapvető kérdések a gének szabályozásával kapcsolatban. J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

24 szervszintű (pl. agyban vagy vesében) az egyedfejlődés során (pl. magzati vagy felnőtt szövetek) a környezeti hatásokra adott dinamikus válasz (pl. korai válaszadó gének) betegség hatására génaktivitás Génexpresszió és betegségek: jó korreláció az RNS expressziós szintek és a fenotípus között. A génexpresszió szabályozásának alapesetei J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

25 cDNS DNSRNS protein cDNS DNSRNS protein UniGene SAGE Microarray J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics A génexpresszió globális analízise TÁMOP /1/A

26 A génexpresszió az a folyamat, melynek során a génben levő információ struktúrákká (protein) és sejtbeli funkciókká fordítódik le. A microarray alapkoncepciója, hogy egyedileg mérje a mRNS-ek mennyiségét, és ezáltal azonosítsa, mely géneket expresszálja (használja) a sejt. Microarray cDNS DNSRNS protein cDNS DNSRNS protein TÁMOP /1/A

27 Pillanatfelvétel, mely egyszerre többezer gén aktivitását rögzíti. Szabályos mátrixba rendezett, próbákat tartalmazó mikropöttyök összessége, ahol minden pötty egyféle szekvenciájú nukleinsavat (próbát) tartalmaz, ami egy génnek felel meg. Génexpressziós microarray-k A rendszer alkotóelemei: szilárd hordozófelület DNS próbák: cDNS vagy oligonukleotida, ismert gének homológjai Vizsgálandó minták (mRNS-ből jelölt cDNS) Szkenner (szignál rögzítés) Számítógépes algoritmus (adatelemzés) TÁMOP /1/A

28 Nyomtatott expressziós array-k Affymetrix expressziós array-k TÁMOP /1/A

29 TÁMOP /1/A

30 Kontroll Teszt Fluoreszcensen jelölt próbák készítése Hibridizálás mosás szkennelés Fluoreszcencia mérése, két csatornán piros zöld Adatanalízis génexpressziós mintázat azonosítása Nyomtatott expressziós array-k TÁMOP /1/A

31 Kontroll Teszt Biotinnal jelölt próbák készítése Hibridizálás festés mosás Szkennelés Analízis Affymetrix expressziós array-k TÁMOP /1/A

32 A microarray minőségi konzorcium (MAQC) A MAQC Konzorcium cikksorozatot publikált a Nature Biotechnology- ban : 2006 szeptember, 24(9). 20 mikroarray terméket és háromféle technológiát értékeltek, RNS transzkript expresszióját vizsgálva humán tumorsejtvonalakban vagy agyszövetben. A kísérleteket végző laboratóriumok és a különböző platformok eredményeiben (szabályozott gének) nagyban megegyeztek. J Pevsner: Bioinformatics and functional genomics TÁMOP /1/A

33 MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24: TÁMOP /1/A

34 MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24: TÁMOP /1/A