Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

REKOMBINÁNS ANTITESTEK ÉS A PHAGE DISPLAY TECHNIKA Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Csősz Éva Molekuláris terápiák – 7. előadás

A 7. fejezet célja, hogy bemutassa a terápiák során felhasznált antitestek termelésének lehetőségeit és korlátait. A fejezet során bemutatásra kerül az antitestek termelődésének folyamata, a terápiás antitestek termelése hibridómákban illetve a nagyfokú antitest diverzitás biztosítása fág diszplay segítségével. A 7. fejezet témakörei 7.1. Áttekintés Az antitestek szerkezete és termelődése a szervezetben Antigén – antitest kölcsönhatás 7.2. A terápiás antitestek termelése Antitestek termelése hibridómákban Humanizált antitestek Humán antitestek termelése 7.3. Antitestek termelése fág diszplay segítségével A fág diszplay technika bemutatása Fág könyvtárak készítése 7.4. A terápiás antitestek alkalmazása TÁMOP /1/A

Nehéz lánc: konstans régió, variábilis régió Könnyű lánc: konstans régió, variábilis régió Hinge régió Szupervariábilis régió Diszulfid hidak COO - NH 3 + VHVH VHVH VLVL VLVL C H3 CLCL CLCL C H2 C H1 F ab régió Fc régió Az antitestek szerkezete TÁMOP /1/A

V H1 V H2 D Hn D H1 V Hn V H4 V H3 J H1 CC CµCµ J Hn J H3 J H2 C  CC C α J H2 D H1 V H4 C  IgG Nehéz lánc kb. 85 génkb. 27 génkb. 6 gén Az antitestek nehéz láncának szerkezete TÁMOP /1/A

VL1VL1 VL2VL2 VLnVLn VL4VL4 VL3VL3 JL1JL1 CC JLnJLn JL3JL3 JL2JL2 JL3JL3 VL2VL2 CC kappa könnyű lánc kb. 35 kappa génkb. 5 kappa gén kb. 30 lambda gén kb. 4 lambda gén Az antitestek könnyű láncának szerkezete TÁMOP /1/A

B sejt Antitest Az antitestek termelése a B sejtekben TÁMOP /1/A

Rekombináció Kapcsolódási diverzitás Szomatikus hipermutáció B sejt Antigén/epitóp Plazma sejt Specifikus antitest BCR Y Y Y Y B sejt Klonális szelekció Klonális expanzió A klonális szelekció és klonális expanzió TÁMOP /1/A

Y Y Y Y B sejt Antitest Antigén Epitóp Antitest Poliklonális antitestek TÁMOP /1/A

B sejt Antigén Epitóp Antitest Monoklonális antitestek TÁMOP /1/A

Lépsejtek izolálása HGPRT Antitest termelés Mielóma sejtek HGPRT  Antitest termelés  Egér immunizálása Antigén Lépsejtek és mielóma sejtek fúziója, a hibridóma sejtek létrehozása Hibridómák szűrése és szaporítása Antitestek izolálása Y Y Y Y Y Y Y Antitestek termelése hibridómákban TÁMOP /1/A

Egér antitest Humán antitest Humanizált antitest / kiméra antitest Humanizált antitestek TÁMOP /1/A

Egér immunoglobulin gén Humán immunoglobulin gén Humán vagy humanizált antitestek termelése Humán antitestek termelése génmódosított egerekben TÁMOP /1/A

5 db p9 5 db p7 5 db p3 5 db p db p8 DNS kb M13 bakteriofág E. coli 900 nm Az M13 bakteriofág szerkezete TÁMOP /1/A F-pilus

Immobilizált fehérje / affinitás mátrix Specifikus elúció Az immobilizált fehérjékhez kötött fágok specifikus elúciója TÁMOP /1/A

mátrix Enzim fág diszplay TÁMOP /1/A

mátrix Szubsztrát fág diszplay I. TÁMOP /1/A

mátrix Szubsztrát fág diszplay II. TÁMOP /1/A

mátrix Enzim-szubsztrát fág diszplay I. TÁMOP /1/A

mátrix Enzim-szubsztrát fág diszplay II. TÁMOP /1/A

Fágmid Rekombináns fágmid Változatos szekvenciák sokasága Fág könyvtárak készítése TÁMOP /1/A

hGH génProteáz szubsztrátM13 gIII gén Fágmid vektor hGH gén Proteáz szubsztrát M13 gIII gén Fágmid vektor Változatos szekvenciák létrehozása Fág könyvtár Proteáz szubsztrát szekvencia Proteáz szubsztrát fág könyvtár készítése TÁMOP /1/A

hGH receptor mátrix Proteáz Alacsony pH Proteáz rezisztens szekvenciák Proteáz érzékeny szekvenciák Szekvenálás Proteáz Szubsztrát fág diszplay – proteáz hasítóhelyek fejlesztése TÁMOP /1/A

Fág könyvtár beadása intravénásan A fágok az erek falán expresszált fehérjékhez kötődnek Biopszia A kötődött fágok lemosása A kötődött fágok szaporítása A fágok által hordozott peptidek/fehérjék azonosítása In vivo fág diszplay – ér endothel sejtek térképezése TÁMOP /1/A

Limfociták mRNS cDNS Antitest specifikus primer Teljes vér (Immunizált donor) Antitest génekFágmid E. coli sejtek 10 8 különböző antitest génjét tartalmazzák Antitest könyvtárak készítése teljes vérből TÁMOP /1/A

Y Y Y Y Y Y Y Tumor sejt Ölő sejt (NK sejt vagy monocita) Tumor ellenes antitestek Fc receptor Antitest függő citotoxicitás mechanizmusa TÁMOP /1/A

TNFalfa IL2 receptor alfa lánc Transzplantáció utáni szervkilökődés megakadályozására, főként veseátültetések esetén Pszoriázis Reumatoid arthritisz Crohn betegség Spondilitisz Humán-egér kiméra antitest Monoklonális antitestek Adalimumab Infliximab Golimumab Cetrolizumab pegol Basiliximab Immunszupresszáns hatású terápiás antitestek alkalmazása TÁMOP /1/A

Bispecifikus antitest (kb. 300 kDa) IgG - scFv (Fab – scFv) 2 A terápiás antitestek változatai TÁMOP /1/A

Fv Tandem scFvDiabodyTriabody Bispecifikus antitest F(ab’) 2 Fab scFv S-S scFv 2 dsFv S-S Nanobody A kisméretű terápiás antitestek változatai TÁMOP /1/A