Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szöveti regeneráció (3) Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 19. Előadás Szöveti regeneráció (3)

Szívelégtelenség Az egyik leggyakoribb betegség Nagy morbiditás és mortalitási ok a fejlett országokban Okok: Veleszületett rendellenességek Magas vérnyomás Szívinfarktus Mérgek, toxinok Fertőzések

Szívizom regenerációs terápiák A szívizom regenerációját célzó terápiák a kutatások fókuszában vannak: A szívelégtelenség előfordulása egyre gyakoribb az életkor előrehaladásával A fejlett országokban a populáció egyre inkább öregszik A szívinfarktust túlélő betegek száma növekszik A legtöbb MI túlélő szívelégtelenségben szenved

LVAD A bal kamra pumpafunkcióját segíti Pulzálás vagy Folyamatos pumpálás 7 év az LVAD-al viselési rekord

Bal kamra kisegítő eszközök Szívtranszplantációra váró betegekben: A megfelelő donor megtalálásáig életben tartja a szívelégtelenségben szenvedő beteget A kezelés maga is segíti a sérült szívizom regenerációját Javítja az életminőséget Transzplantációra alkalmatlan betegeknél: Palliatív terápia Szövődmények lehetnek: Infekció veszélye Alvadási rendellenességek veszélye Embolizáció veszélye

Csontvelői sejtek a szívizom regenerációban Mesenchimális őssejtek Hemopoetikus őssejtek Side population sejtek Vázizom Szatellita sejtek Side population sejtek Vérerek Endotél progenitor sejtek (hemangioblasztok) Szív Side population sejtek Kit+ sejtek Sca-1+ sejtek Fúziós és nem-fúziós differenciációs út

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban I. Csontvelői sejtek (BMC) Hemopoetikus őssejtek részt vehetnek a szívizom regenerációjában Intenzíven tanulmányozott terület állatkísérletes modellekben különböző módon jelölt BMC-kkel Eltérő nemű donortől származó graftok betegekben Sérülés után BMC homing tapasztalható a sérült területre GCSF moblizáció nem reprodukálja a BMC helyi injektálásának eredményeit

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban II. Intravenás infúzió Szelectív intrakoronáriás infusion Direkt intramiocardiális injekció Fúzió a residens kardiomiocitákkal Differenciáció a szívre jellemző fenotípussá Parakrin faktorok szekréciója Differenciáció érfal komponensekké Perivaskuláris inkorporáció ↓Kardiomiocita apoptosis Rezidens őssejtek toborzása Kardiomiocita proliferáció Matrix: Hegszövet kompozíció Granulációs szövet Pro-angiogén cytokinek Angiogén ligandok ↑Funkcionális kardiomiociták száma ↑Perfúzió ↑Szív teljesítménye

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban III. BMC transzdifferenciációjára szívizomsejtekké nincs direkt bizonyíték Ha egyáltalán előfordul, nagyon ritka esemény Talán az egyetlen nyilvánvaló terápiás előny a sérült szívizomszövet megnövekedett vaszkularizációja, amely a saját regenerációs kapacitást növeli.

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban IV. A szívizomsejtek megtartott osztódási képessége bizonyított tény Többfajta őssejt-markereket (Sca-1, CD31) és szívizom-markereket expresszáló, proliferáló sejttípus mutatható ki a szívizomban 5- azacitidin-indukálta sérülés után Rágcsálókban és emberekben is kimutatható Jó proliferációs képesség

Szívizom sejtes terápiája Egy sejtmag (centrális) Gap junction (+) Cx43 expresszió (+) Vázizomrost Sokmagvú (perifériás) Gap junction (-) Cx43 expresszió (-) ??? Myotubulus Sokmagvú Gap junction (-) Cx43 expresszió (-) Myoblaszt (szatellita sejt) Egy sejtmag Gap junction (+) Cx43 expresszió (+) Proliferáció (+) Fúzió és differenciáció

Vázizom myoblasztok Biopsziából származó vázizom mioblasztokat alkalmaztak korai stádiumú klinikai kipróbálás során Szívizom teljesítmény és életminőség növekszik: Csökken a NO szükséglet Javul az NYHA besorolás Javul a fizikai terhelhetőség A betegeknél kamrai aritmiák fordultak elő Néha ICD beültetése vált szükségessé A vizsgálatokban részt vett betegek száma alacsony volt Nem volt kezeletlen kontroll csoport ezekben a vizsgálatokban

Embrionális őssejtek A szívizommá differenciálódási képesség bizonyított hESC-eket beültetés előtt differenciáltatni szükséges A sérülés önmagában nem indukálja a hESC növekedését és a szívizommá való differenciációt, sőt, gyulladásos citokinek károsíthatják a beültetett sejteket Gyulladáscsökkentő és más védő anyagok alkalmazása szükséges a graft támogatásához (IGF-1, pán-kaszpáz inhibitorok és NO blokkolók) A differenciálódott szívizomsejtek immunválaszt váltanak ki immunkompetens egerekben. Teratoma kialakulása is kockázatot jelent. Jelenleg kérdéses a klinikai alkalmazás jövője.

Tissue engineering megoldások fogpótlásban A fogazat nagyon fontos a gerincesek táplálkozásában A fogzási rendellenességek vagy a hiányos szájhigiéné nem életet veszélyeztető kondíció a fejlett országokban Ennek ellenére a fogazat károsodása és betegségei jelentősen csökkentik az életminőséget

Fogfejlődés Kölcsönös jelátviteli események az epitélium és az alatta lévő mesenchyma között A morfogenezis és a végleges differenciáció megkezdődése Csíra szakasz Epitéliális sapka szakasz (körbeveszi a mesenchymát) Harang szakasz Koronai szakasz Fogkorona Dentin Odontoblaszt Zománc Cement Pulpaüreg Fogíny rost Periodontális membrán Sharpey rost Fogágy csont Foggyökér Vérér Idegrost

Fogbél eredetű őssejtek (DPSC) A DPSC-k multipotens sejtek a fogbélben (pulpa dentis) Fontos szerep a dentin sérülés utáni regenerációjában Odontoblasztok jelennek meg a sérülés helyén Differenciálatlan mezenchymális sejtek folyamatosan vándorolnak a mélyebb rétegekből a dentin felé és odontoblaszt irányú differenciáció figyelhető meg Kísérleti bizonyítékok utalnak arra, hogy a migráló sejtek a DPSC-k.

A DPSC-k differenciációs képessége Emberi DPSC-k tenyésztése mineralizációt serkentő körülmények között A sejtek odontoblaszt-szerű sejtekké differenciálódnak, dentint termelnek és nestin-pozitívak A DPSC-k fenotípusosan az MSC-kre emlékeztetnek, de a dentin-termelő képességük egyedi

Tissue engineering a fogpótlásban Fogképző sejtek screenelése Sejt ko-kultúra 3D körülmények között Fogcsíra szövetkonstrukció transzplantációja Epitéliális sejtek Betegből izolált őssejtek Fogcsíra szövetkonstrukció Mezenchymális sejtek A transzplantált szövetkonstrukció foggá fejlődik In vitro tenyésztett fogkonstrukció Transzplantáció

Fog előállítása mesterséges körülmények között I. Scaffold-alapú foggyökér: Biokompatibilis anyagból készült gyökér-implantátum, amelyre mesterséges (pl. porcelán) koronát rögzítenek A sejtek belenőnek a scaffold anyagába, így biztosítják a rögzítést Sertés állatmodellen végzett kísérletek bizonyítják a megvalósíthatóságot

Fog előállítása mesterséges körülmények között II. Az embrionális fogfejlődés mesterséges reprodukálása: Az embrionális fogfejlődés tökéletesen azonos funkciójú fogat eredményez A foggyökér és a korona is kifejlődik Rágcsáló kísérletek sikeresek voltak Nem csak embrionális, hanem újszülött vagy felnőtt eredetű sejtek is képesek voltak a fog kinövesztésére Scaffold alapú és scaffoldmentes rendszerek is kipróbálásra kerültek

Szöveti regeneráció (4) Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 20. Előadás Szöveti regeneráció (4)

Húgyivari szervek sérülésének okai Húgyivari szervek sérülései vagy funkcióvesztése: Fejlődési rendellenességek Trauma Fertőzés, gyulladás Orvosi beavatkozás mellékhatása (iatrogén ok)

Megoldások a húgyivari szervek szöveti regenerációjában Saját nem-húgyivari eredetű szövetek: Bőr Gasztrointeszinális eredetű szövetek Más szervekből kivett nyálkahártya Allogén eredetű szövetek: Kadáver vagy élődonoros eredetű vesegraft Kadáver eredetű fascia Xenogén anyagok: Szarvasmarha kollagén Mesterséges anyagok: Szilikon Polyuretán Teflon

Sejtek izolálása szöveti regeneráció céljára Autológ vagy allogén Végstádiumú szervelégtelenség gyakran behatárolja a szöveti regenerációra alkalmas sejtek mennyiségét In vitro tenyésztési eredmények különbözőek: In vitro tenyészett hólyag simaizomsejtek: alacsony kontraktilitás Alacsony sejtszám behatárolja a regenerációs lehetőségeket Őssejtek jelenthetik a megoldást Terápiás klónozás is megoldást jelenthet

Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában I. Mesterséges anyagok ECM funkciók pótlása: 3D struktúra kialakítása a szövet kialakulásának támogatására Sejtdifferenciáció szabályozása és serkentése bioaktív molekulák tárolása és leadása útján Sejtek injektálása a megfelelő scaffold támogatása nélkül nem eléggé hatékony

Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában II. Természetes eredetű bioanyagok Kollagén Alginát Sejtmentes szöveti alapanyagok: Hólyagi submucosa Vékonybél submucosa (SIS) Szintetikus polimerek PLA, PGA, PLGA

Urothelium – különleges funkciók Kiválasztó, nem felszívó funkció Jelenlegi sebészeti rekonstrukciós megoldások a gasztrointesztinális autograftokat részesítik előnyben a húgycső, húgyvezeték vagy a hólyag sérüléseinek a rekonstrukciójában Az intesztinális hám és az urothelium különböző szerkezete és funkciója gyakran okoz mellékhatásokat, amelyeknek súlyos következményeik is lehetnek

Húgycső rekonstrukció I. Szűkületek, sérülések, trauma, fejlődési rendellenességek (pl. hypospadiasis) Leggyakrabban a bukkális nyálkahártyát használják graftként a rekonstrukciós sebészetben: A graftot a pofa vagy az ajkak belső felszínéről veszik A hám vastag és a nyálkahártya erezete gazdag Emiatt a graft ellenálló a fertőzésekkel szemben

Húgycső rekonstrukció II. Hólyag-eredetű urotélium: Megfelelőnek bizonyult a rekonstrukcióban nyulakban Klinikai kipróbálás eddig nem volt Sejtmentes kollagén szövetek: Az anyag szükség szerint rendelkezésre áll Az eredmények jók a „csak” rekonstrukciós sebészeti megoldások esetében A szűkületek gyakoriak, ha a húgycsövet teljes átmérőjében, tubularizáltan kell rekonstruálni

Húgycső rekonstrukció III. Sejtmentesített és tubuláris scaffold konstruktok, amelyekre autológ urotéliumot növesztettek: Állatkísérletes eredmények biztatóak A szövetkonstrukciók hisztológiai szerkezete a natív urotéliumhoz hasonlatos Kollagén scaffold sejtek kiültetése nélkül szűkületet eredményezett

Hólyag rekonstrukció I. Leggyakrabban intesztinális eredetű nyálkahártyát használnak rekonstrukcióra: Az intesztinális hám különbözik az urotéliumtól Az intesztinális hám szerepe a táplálék abszorpció és a nyákszekréció Szövődmények: infekció, vesekő, anyagcsere rendellenességek, perforáció, megnövekedett nyákszekréció, rosszindulatú daganatok kialakulása Az ellentmondásos eredmények miatt alternatív terápiás lehetőségek felé fordult az érdeklődés

Hólyag rekonstrukció II. Hólyag megnagyobbító megoldások: A húgyhólyag progresszív dilatációja a leggyakrabban alkalmazott konzervatív megoldás Augmentációs cisztoplasztika: a hólyag megnagyobbítása húgyvezeték-eredetű urotéliummal Jobb eredmények érhetőek el ezzel a megoldással, mint a gasztrointesztinális eredetű graftokkal

Hólyag rekonstrukció III. Sejtmentes ECM-eredetű anyagok: Xenogén SIS → sejtmentesített kollagén- alapú szöveti mátrix → nincsen mukózális izomréteg (str. muscularis mucosae) A graft hámosodása rendben lezajlott Az izomréteg miatt a kontrakciós compliance akadályoztatott Scaffold-okra ültetett hám- és simaizomsejtek: Az izomréteg sikeresen kialakult, a kontrakciós compliance megfelelő Scaffold-ok: PGA és kollagén kombinációja

Húgyvezeték rekonstrukció Húgyvezeték rekonstrukció állatokban: Sejtmentes scaffold-ok beültetésével sikeres volt a húgyvezeték fal minden rétegének a regenerációja patkányokban Merev anyagokból készült csövek (teflon) beültetése nem bizonyult sikeresnek kutyákban 3cm hosszú csőszerű sejtmentes scaffold-ok beültetése kutyákban szűkület kialakulásához vezetett Sejtes scaffoldok beültetése sokkal kielégítőbb eredményekhez vezetett kutyakísérletekben

Vesepótló kezelések Jelenleg rutinszerűen két típusú kezelést alkalmaznak a végstádiumú veseelégtelenség (ESRF) kezelésében: Művesekezelés (Dialízis) Vesetranszplantáció

Dialízis Hemodialízis, hemofiltráció Dializátorok: szintetikus anyagból készült porózus rostok alkalmazása a leggyakoribb Alvadásgátolt vénás vért eresztenek át a dializáló berendezésen, ellenáramú dializáló oldatot alkalmaznak Hasi (Peritoneális) dialízis A dializáló oldatot katéteren keresztül a hasüregbe vezetik A toxikus metabolitok és a felhalmozódott víz eltávolítása a betegből a plazma és a dializáló folyadék közötti ozmotikus különbségeken alapul Szív- és érrendszeri, metabolikus és mozgásszervrendszeri szövődmények előfordulása gyakori

Vesetranszplantáció A leggyakrabban átültetett parenchimás szerv Kadáver vagy élő donor A dializált betegekhez képest jelentősen javul az életminőség Allogén eredetű graft beültetése után immunszupresszív kezelés szükséges Az immunszuppresszív kezelés mellékhatásai: fertőzések és malignus daganatok kialakulására való hajlam növekedése, máj- és vesetoxicitás, szív- és érrendszeri, valamint metabolikus mellékhatások

TE vese előállítása I. Bioartificiális megközelítés: A dializáló gépek helyettesítése biológiai művesével Extrakorporeális és beültethető változatok is Preklinikai kísérletek kutyákon sertés vese tubulus sejtekből kialakított biológiai művesével: sikeres karbamid és kálium-szint kontroll Legnagyobb hátrány: a beteg még így is géphez kötve éli az életét

Biológiai művese Rostok fala Lumen Proximális tubulus sejtek Hőcserélő Pumpa 2 5-7 ml/min Lumen Proximális tubulus sejtek 5-10 mm Hg RAD dializátor Extrakapilláris tér Pressure monitor Szürlettartály 10-25 mm Hg Hőcserélő Feldolgozott szűrlet (vizelet) Hemofilterből jövő vér (RAD extrakapilláris térbe) Dializátorból jövő vér Ultrafiltrátum (RAD lumenbe) Plazmapótló folyadék Hemofilter Pumpa 3 70-80 ml/min Pumpa 1 80 ml/min Vénás vér

TE vese előállítása II. In vivo megközelítés: Humán vesesejteket tubuláris polikarbonát scaffoldkonstrukcióra ültettek Immundeficiens egérbe való beültetés során megfelelő sűrűségű érhálózat alakult ki Vizeletszerű folyadék termelése: karbamid és kreatinin tartalom A hámsejtek tubuláris differenciáció jeleit mutatták

In vitro előállított egér vese Sejtek Bimbó Bimbó Wolff cső Sejtek Metanefrikus mesenchyma 4-6 nap