Az immundeficienciák kimutatásának laboratóriumi módszerei Nagy Gábor DEOEC III. Belgyógyászati Klinika Regionális Immunológiai Laboratórium ODLA III. évfolyam Immunológiai diagnosztikai módszerek 2010. március 16.

Diagnosztikai algoritmus

Első vizsgálatok: vérkép metodika: optikai elv impedancia elv paraméterek: össz fehérvérsejt szám absz. limfocita szám absz. granulocita szám thrombocita szám és méret (MPV)

Első vizsgálatok: össz IgG, IgA, IgM Turbidimetria A fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri Nefelometria A szórt fény intenzitását méri

Immunglobulin szintek életkor függése IgG Immunglobulinok mennyisége IgA IgM

Immunglobulin szintek: össz IgE Több nagyságrenddel alacsonyabb koncentráció ELISA (indirekt jelölésű) kU/l hiper IgE-sy

Össz Ig szintek változása immundeficienciákban hipogammaglobulinémia esetén ki kell zárni a veszést (pl. nephrosis sy) Szelektív IgA hiány: se és nyál IgA mérhetetlenül alacsony Hiper IgM: IgM, IgA, IgG Hiper IgE: IgE  (>2000 kU/l) congenitális agammaglobulinémia: IgG, A, M   CVID: Ig  (>=két Ig osztályban) ALPS: Ig 

Szűrő jellegű vizsgálatok Immunológiai szűrőtesztek immundefektus gyanúja esetén Feltételezett immundefektus Immunológiai teszt Humorális Szérum -IgM, -IgG, -IgA és alosztály vizsgálatok Izohemagglutinin-titer Fehérje antigénre adott immunválasz (Diphtheria toxin e.antitest, Tetanus toxin e.antitest) Poliszacharid antigénre adott immunválasz (H.influenzae e.antitest, Pneumococcus e.antitestek) Sejtes Abszolút limfocitaszám Tuberkulin-bőrteszt Tetanus-bőrteszt Diphteria-bőrteszt Candida-bőrteszt Fagocitasejt-defektus Abszolút granulocitaszám NBT teszt Szérum IgE Komplementdefektus Összkomplement-aktivitás mérése hemolitikus módszerrel (klasszikus és alternatív út)

Humorális immunrendszer: IgG alosztályok G1, G2, G3, G4 alosztályok metodika: nefelometria az össz IgG ált normális tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik) izolált alosztály deficiencia szelektív IgA hiány mellett gyakran

Izohemagglutinin az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miatt hiányuk B-sejt defektusra utal módszer: hemagglutináció hiányzik: pl. CVID

Fehérje és poliszacharid specifikus antitestek Fehérje antigénre adott immunválasz Diphtheria toxin e. antitest Tetanus toxin e. antitest Poliszacharid antigénre adott immunválasz H. influenzae e. antitest Pneumococcus e. antitestek Meningococcus e. antitestek módszer: ELISA

Fehérje és PS specifikus antitestek csökkent válasz: CVID

Sejtes immunrendszer vizsgálatai: Absz. limfocita szám életkorfüggő referencia tartomány elsősorban a T-sejtszámot tükrözi limfopénia: SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis) cong. agammaglobulinémia csökken lehet: CVID

Bőrtesztek T-sejt funkció jó szűrőtesztje vírus és gomba fertőzések antigén: Tuberkulin-bőrteszt Tetanus-bőrteszt Diphteria-bőrteszt Candida-bőrteszt elve: késői típusú hiperszenz. in vitro: limfocita proliferációs tesztek

Áramlási citometria

Áramlási citometria T limfocita markerek: CD3, CD2, CD7 B limfocita markerek: CD19, CD20, CD21 Helper T limfocita marker: CD4 Citotoxikus T limfocita marker: CD8 NK sejt markerek: CD56, CD16 T sejt aktivációs markerek: CD69, CD25, HLA-DR Neutrofil granulocita markerek: CD16, CD32 Monocita markerek: CD13, CD14 Makrofág markerek: CD36, CD68, CD71

Áramlási citometria limfocita szubpopuláció: T: CD3+ B: CD19+ Th: CD4+ Tc: CD8+ B: CD19+ NK: CD16+, CD56+

Áramlási citometria Betegség B T NK Bruton-kór - + CVID +/- gamma-lánc def ADA PNP RAG1/2 def. MHC-I def. +(CD8) MHC-II def. +(CD4) DiGeorge-sy

Áramlási citometria CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM) MHC I-II (MHC deficienciák) CD4-/CD8- T-sejt : ALPS Treg  (CD4+,CD25bright,FOXP3+): Immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX)

ADA, PNP enzimaktivitás purin anyagcsere enzimei Adenozin dezamináz: adenozin-inozin átalakítás Purin nukleozid foszforiláz: guanozin-guanin inozin-hipoxantin átalakítás Súlyos kombinált ID ADA: T és B PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek magas dGTP tartalma miatt)

ADA, PNP enzimaktivitás eritrociták enzimaktivitását határozzuk meg vvt-ket 3x mossuk beállítjuk a hgb-t lizáljuk a vvt-ket megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez adenozin (ADA) inozin (PNP) a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjük az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk meg

ADA, PNP enzimaktivitás az enzimaktivitás: homozigóta formában mérhetetlenül alacsony heterozigóta formában kb. az kontrollok fele parciális ADA deficiencia: vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más szövetekben van (instabil enzim)

Fagocita rendszer vizsgálatai: abszolút neutrofil szám Kostmann sy ciklikus neutropénia Chediak-Higashi sy reticularis dysgenesis WHIM sy (Wart, Hypogammaglobulinemia, Infection, and Myelokathexis syndrome) kemoth. gyógyszerek immun nonimmun autoimmun alloimmun hiányállapotok (B2, folsav, réz) AIDS

Fagocita sejtek vizsgálata: granulocita ellenes at. a mérés elve lehet: áramlási citometria sejtes ELISA

Fagocita sejtek vizsgálata: funkcionális vizsgálatok adherencia granulocita szám mérés üveggyönggyel inkubáció adhezív proteinek (áramlási citometria): LAD1: CD11a,b,c/CD18 LAD2: CD15 kemotaxis Boyden-kamra

Fagocita sejtek vizsgálata: funkcionális vizsgálatok fagocitózis mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba) FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal preopszonizált E. coli telepszámlálás: be nem kebelezett baktérium visszamérése intracelluláris killing telepszámlálás: bekebelezés után életben maradt baktériumok visszamérése

Fagocita sejtek vizsgálata: funkcionális vizsgálatok oxidatív burst NBT (nitroblue-tetrasolium) redukció sárga NBT->kék/fekete formazán mikroszkópos kiértékelés DHR (dihidro-rodamin) oxidáció DHR->rodamin (fluoreszkál) teljes vér kemilumineszcencia H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + foton szuperoxid anion termelés ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés) csökkent: CGD

Fagocita sejtek vizsgálata: enzimdefektusok MPO primer, azurofil granulumban található enzim H2O2->HOCl deficienciája gyakori: 1:2000 benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék szín

Fagocita sejtek vizsgálata: mikroszkópos morfológia Chediak-Higashi sy kóros a fagolizoszóma formálás

Komplement rendszer: deficienciák

Komplement rendszer: össz komplement aktivitás klasszikus út: CH50 szenzitizált birka vvt. alternatív út: AH50 nyúl vvt.

Komplement rendszer: CH50 meghatározás 50x 100x 200x 400x Vak Spontán lísis kontroll Teljes lízis kontroll Beteg1 Beteg2 Betegx hemolízis%= (ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)

Komplement rendszer: CH50 meghatározás logx=logK+1/n*log(y/(1-y)) x=szérum térfogat y=hemolízis% CH50=annak a szérumtérfogatnak a reciproka, ami 50%-os lízist okoz

Komplement rendszer: értékelés CP AP C3 C4 Magyarázat N C1q, C1r, C1s, C2 deficiencia  C3 def. C4 def. C5-C9 def  HANO CP comsumptio

Komplement rendszer: egyes faktorok antigén meghatározás: radiális immundiffúzió rakétaelektroforézis nefelometria ELISA funkciónális meghatározás: hemolitikus assay (a mérendő faktor kivételével a faktorok feleslegben) klasszikus út komponensei: szenzitizált birka vvt. alternatív út komponensei: nyúl v. tengerimalac vvt.