SiRNAs: APPLICATIONS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND POTENTIAL AS THERAPEUTICS Yair Dorsett and Thomas Tuschl Nature 318 | APRIL 2004 | VOLUME 3 (www.nature.com/reviews/drugdisc)

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
A mutagenezis célja, haszna Mutáció Az egyed megjelenése (fenotípusa) megváltozHAT Ebből visszakövetkeztethetünk a mutációt szenvedett gén funkciójára.
Advertisements

Betegség-orientált kutatás-technológiai platform
BioGén tábor 2006 DNS szekvencia analízis, internetes adatbázisok a genetika szolgálatában Kósa János Semmelweis Egyetem ÁOK I.sz Belgyógyászati Klinika.
Delta Bio 2000 Kft. Ügyvezető: Dr. Haracska Lajos
ENZIMOLÓGIA 2010.
Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
A T sejtek ontogenezise III. Matkó János,
Fehérjeszintézis Szakaszai Transzkripció (átírás)
Kemogenomika Markus Bredel és Edgar Jacoby ‘Chemogenomics: an emerging strategy for rapid target and drug discovery’ című cikke alapján készítette: NAGYŐSZI.
Az intergénikus régiók és a genom architektúrájának kapcsolata Craig E Nelson, Bradley M Hersh és Sean B Carrol (Genome Biology 2004, 5:R25) Bihari Péter.
Genome2D: bakteriális transzkriptóma megjelenítését szolgáló eszköz (szoftver) Csernetics Árpád Bioinformatika SZIT ápr. 18.
Bioinformatika Dr. Miskei Márton Tudományos munkatárs.
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
Az immunoglobulin szerkezete
Egyéb öröklődési típusok és epigenetika Láng Orsolya október 20.
Molekuláris genetika Falus András.
Kedvenc Természettudósom:
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító.
génszabályozás eukariótákban
Génexpresszió (génkifejeződés)
Új irányzatok a biológiában Fehérjék szerkezete, felosztása
MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI
Epigenetika és életmód
GAZDA GRAS: generally recognized as safe Intracelluláris / szekréció Proteázok Termelés, szekréció szinkronizálás Gazda kialakítása.
Poszttranszlációs módosítások Készítette: Cseh Márton
Transzdukció Készítette: Őri Zsuzsanna Emese 2007.március 30.
Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)
Génmanipulált növények biztonsága Smeller Margit
Készítette: Leidecker Orsolya
Elektroporáció.
Készítette: Kiss László
2009. november 26. Transzgének expressziós profiljának felvétele Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények.
Géntechnikák Labor FÁG DISPLAY
Készítette: Sólyom Katalin Április 22.
Készítette: Juhász Orsolya
DNS chipek, DNS hibridizáció
FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ
Nukleotid típusú vegyületek
Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése
Az Alzheimer-kór filozófiája
NUKLEINSAVAK MBI®.
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
ELŐNYÖK ÉS LIMITÁCIÓK MOLEKULÁRIS MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ALKALMAZHATÓSÁGA A BIOREMEDIÁCIÓBAN Balázs Margit.
Biopeszticidek Készítette: Pásztor András március 22.
1, GÉNKÖNYVTÁRAK ALKALMAZÁSA
A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
A SEJTCIKLUS ÉS A RÁK KAPCSOLATA
A P elem technikák: génmanipuláció tetszés szerint
A foszfát csoport az S, T és Y oldalláncok hidroxil- csoportjához kapcsolódik.
Hatott-e az APOBEC-enzimcsalád a vírusok kodonhasználatára? Összehasonlító genomikai vizsgálat Müller Viktor 1,2 & Sebastian Bonhoeffer 2 1 ELTE 2 ETH.
Az egyedfejlődés második rész.
Receptor és szenzor fehérjék számítógépes tervezése Összeállította: Kiss Lóránd 2009.április.24. Bioinformatika szakirodalmi tanulmányok.
A genom variabilitás orvosi jelentősége Gabor T. Marth, D.Sc. Department of Biology, Boston College Orvosi Genomika kurzus – Debrecen, Hungary,
Génexpressziós chipek mérési eredményeinek biklaszter analízise.
PLAZMA SEJT ANTIGÉN CITOKINEK B-SEJT A B – SEJT DIFFERENCIÁCIÓT A T-SEJTEK SEGÍTIK IZOTÍPUS VÁLTÁS ÉS AFFINITÁS ÉRÉS CSAK T-SEJT SEGÍTSÉGGEL MEGY VÉGBE.
Antisense RNS.
Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása)
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
34. lecke A fehérjék felépítése a sejtben. Lényege: Lényege:  20 féle aminosavból polipeptidlánc (fehérjelánc) képződik  A polipeptidlánc aminosav sorrendjét.
Vakcinák. Edward Jenner Fekete himlő Tehén himlő Fekete himlő Tehén himlő
RNS TUMORVÍRUSOK (Retrovírusok)
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
Új molekuláris biológiai módszerek
Komenczi Bertalan Információelmélet
ENZIMOLÓGIA.
Új molekuláris biológiai módszerek
A Fabry terápia fejlődése
EPIGENETIKA OLYAN JELENSÉGEKKEL FOGLALKOZIK, AMELYEK KÖVETKEZTÉBEN
Előadás másolata:

siRNAs: APPLICATIONS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND POTENTIAL AS THERAPEUTICS Yair Dorsett and Thomas Tuschl Nature 318 | APRIL 2004 | VOLUME 3 ( Készítette: Lipinszki Zoltán IV. Biológus Bioinformatika szakirodalmi tanulmányok

I. Bevezetés 1.Klasszikus genetika: azonosítja a génmutációt, aminek hatásaként egy ismert funkció, vagy biokémiai útvonal megsérült: időigényes, sokszor nehezen hajtható végre (emlősök). 2.Reverz genetika: génmutációt indukál, hogy ismeretlen funkciót vagy biokémiai utat tárjon fel: időigényes és drága. 3.Nukleinsav alapú megközelítés: genomszekvenciák; szekvencia-specifikus módon képesek vagyunk gének expressziójának elcsendesítésére! Mutációk indukálása vagy keresése nélkül azonosítható a génhez tartozó funkció Andrew Fire és Craig Mello: felfedezik az RNS interferencia jelenségét Caenorhabditis elegans-ban (STORY: dsRNS  azonos szekv  mRNS degradáció)!!! PTGS  Post-transzkripcionális gén „elcsendesítés”

Hosszú dsRNS  növények, gombák, protozoák, sok magasabbrendű eukarióta! Működött!!  a legtöbb emlősben nem működött (INF reakció!!) Rövidebb dsRNS  siRNS már nem váltja ki az INF választ!

II. Nukleinsav-alapú géncsendesítés A három legfontosabb molekula: 1.ODN – Oligo-Deoxi-riboNukleinsav. - ~20 nt - célpont: pre-mRNS és mRNS a. RNS-DNS duplexet képez  RNáz H  degradáció - Kémiailag módosítva  Rnáz H nem köti meg: b. Sztérikus gátat képez: transzláció és splicing inhibítor c. dsDNS-sel tripla hélixet képez: transzkripció inhibítor

2. Ribozimok (ribozyames): - RNS alapú enzimek; szintetikusan és in vivo is előállíthatóak!!! - párosodnak a target RNS-sel (Watson Crick) - katalizálják a foszfátgerinc felszakadását (hidrolízis) - számos csoportjuk ismert: pl. ‘Kalapácsfejű’ ribozimok: kétértékű fémek jelenlétében (Mg++) a fejet (dsRNS) szegélyező cél-komplementer ssRNS szakaszok párosodnak a felismerési szekvenciával a lebontandó-RNS-en.

3. siRNS-ek : -megtalálhatók a természetben: hosszú dsRNS-ből hasogatja le a DICER enzim (Rnáz-III) nt hosszúak: 2 nukleotidos 3’- és 5’-túlnyúló véggel -siRNS + proteinek  RISC (RNS indukálta elcsendesítő komplexum) -Az RISC felismeri azokat az mRNS-et, amelyek komplementerek az siRNS 5’-végének 10 nukleotidjával  HASÍTÁS! -Szintetikusan és in vivo (vektorok) is előállítható.

miRNS- mikroRNS: -a sejt használja génexpresszió szabályozásra -70 nt hajtű prekurzorból vágódik ki: nt -miRNS + proteinek  miRNP  riboszóma\transzláció gátló

III. A géncsendesítő módszerek összehasonlítása -Előnyök-hátrányok- Számos kutatócsoport dolgozott rajta  a hatékonyság sokmindentől függ: 1.Koncentráció (reagens) 2.Transzfekciós technika 3.Sejt típus 4.Célhely kiválasztása 5.Kémiai módosítás 6.Adat analízisek ideje  értelmezése

ODN vs. siRNS: -Az eddigi kísérletek (kivéve kettőt) azt bizonyították, hogy az siRNS-ek hatékonyabban képesek elcsendesíteni a génexpressziót, valamint hosszabb-tartamú a hatásuk, mint az ODN-nek! Ribozim vs. siRNS: -Szisztematikus és kiterjedt vizsgálatokkal megállapították, hogy a gének hatásának elcsendesítésében az siRNS-ek hatékonyabbak, mint a ribozimok. -A ribozimok közül pedig nem a ‘kalapácsfejű’, hanem inkább az ún. ‘hosszú hajtű hurkos’ formák az effektívebbek! ODN : -Az egyes módosított formákról (pl. foszforotiosavval ) kimutatták, hogy toxikusak lehetnek, mert nem specifikusan endogén fehérjékhez kötődnek! -CpG motívumuk TLR-hoz képes kötődni  beindul az INF válasz más öröklött immunitási mechanizmusokkal együtt!!!  Nem specifikus hatás

Rossz  nem specifikus, toxikus Jó  Terápiás alkalmazás rákos megbetegedések és vírusfertőzés esetén! Ribozimok: -Az ODN-hoz hasonlóan, főleg a módosított formák protein segédlet nélkül képesek megkötni a cél-RNS-t:  nagy koncentrációban kell alkalmazni  gyakoribbá válik a nem specifikus felismerés!  Kiküszöbölhető: RNS lokalizációs szignál vagy RNS dajkafehérjék együttes alkalmazásával  kisebb koncentráció!! siRNS : stabilabbak  védettek a ss endonukleázokkal szemben! !!! Fontos az első néhány bp termodinamikai stabilitása !!!  Ennek függvényében dől el, hogy melyik siRNS épül be a RISC-be !!! -RISC komplexben hatékonyabb és kevesebb a nem specifikus felismerés is! -Kis koncentrációban is hatásos! ANTISENSE

Off-target hatás… -A nem specifikus hatás mellett erre is hajlamosak a fenti alkalmazások. -Vagyis megkötik azokat az RNS-et is, amelyek közel hasonló szekvenciával rendelkeznek, mint a cél-RNS. ODN  szereti (Rnáz H-nak csak 6-7 bp kell a hasításhoz) siRNS  ha nincs gondosan kiválogatva ( TERMODINAMIKA ), akkor az endogén miRNS felismerési helyére bekötve leállítja a transzlációt (nem csak egy fehérje esetében) RISC STOP

IV. Vektorok: siRNS termelés -Ribozimok vektorokkal bejuttathatók a sejtbe és indukálható a termelődésük. -Kiderült, hogy a szintetikus előállítás mellett az siRNS-ek is bejuttathatók vektorokkal! -A vektor:  beintegrálódhat a genomba : hosszú távú hatás („kiüti” az endogén transzkriptumot) -adenovírus, adenoasszociált vírus (AAV), retrovírus, lentivírus. polII. vagy polII. promótert használva RNS hajtűt szintetizálnak a transzdukció után  extrakromoszómális elemként  hajtű - lehetőség van fejlődés- és\vagy szövet specifikus bejuttatásra

V. siRNS bejuttatása és in vivo felszabadulása 1.Intravénásan (ODN, klinikai gyógyszerkutatási kísérletek) 2.Plazmidokkal (siRNS, Ribozim) 3.Vírusokkal (siRNS) Emlős modellekbe -elektroporációval -helyi és szisztémás injektálással

PÉLDÁK 1.siRNS injekció: -a nagynyomású farokvénába siRNS-t injektáltak -90%-ban lecsökkent a cél-gén „expressziója” -hely: máj, lép, tüdő, vese, hasnyálmirigy

2. siRNS készítő vírusok: -domináns humán betegségek lehetséges gyógyszerei -génfunkciók vizsgálata emlős szervezetekben -a rekombináns AAV lehetőséget biztosít arra, hogy hosszú távon kifejezhessünk siRNS-t az osztódó és a nem osztódó sejtekben egyaránt! -Egér agyba vagy a májba injektálva a fenti AAV vírust, 7 héttel később nagyfokú célzott génelhallgatás volt detektálható az infekciós terület körül!

-terápia  Ribozimiok: HIV elleni terápiás kezelés  I és II. klinikai fázisban van!!!!!!!!! siRNS: szövetben a HIV-et sikeresen megcélozza!!!  HA TERÁPIÁS SZERKÉNT AKARJUK HASZNÁLNI, AKKOR KI KELL ALAKÍTANI EGY OLYAN ELJÁRÁST, AMELY SZABÁLYOZZA AZ siRNS ENYHE FELSZABADULÁSÁT in vivo! 3. Speciális kis molekulák: -elősegítik a makromolekuláink (pl ODN) transzdermális penetrációját! 4. Aeroszolok: -tüdőbe juttatás

VI. siRNS: in vivo gén funkció felkutatás - Lehetőséget kínál az egér és a patkány génállományának analízisére! - ”Kiütött egerek” készíthetők  előnyösebbnek ígérkezik, mint a homológ rekombináció (idő, pénz, nehézség). - Funkcionálisan redundáns, több kópiás gének esetében ELMÉLETILEG elegendő egyetlen transzgén konstruálása  a kon- zervált domén megcélzása (siRNS) mindegyik gén transzkrip- tumának eliminálásához vezet! - Szabályozható emlősökben is a különféle gének időbeli és szövetspecifikus expressziójának mértéke!!

VII. siRNS: teljes genomi vizsgálatok PÉLDÁKKAL BMUTATVA: 1. C. elegans és D. melanogaster: long dsRNA -”háztartási”és „fiziológiai” gének azonosítása (sejtciklus, apoptózis, sejt morfológia metabolikus gének). 2. Emlősök: - eddig csak nem-emlős gerincesekben lehetett genetikai vizsgálatot végezni (zebrahal) - ELŐSÖKBEN csak kevés genetikai vizsgálatot lehetett végezni (egér) -RNSi  új lehetőségek nyíltak meg! -emlős sejtkultúra -Xenopus oocita -egér, patkány -csirke embrió -humán sejttenyészet „Reverz genetika”-i vizsgálatok

-emlős sejtkultúra  legkedveltebb módszer: *magas hatásfok, kis koncentráció *nagy specificitás *jó stabilitás *közepes ár!!!!! ! apoptózis, szignalizáció, protein stabilitás szabályozása, UV hatás kijavítása ! Így azonosították az egyes komponenseit:

-RNSi alapú vizsgálat emlős sejtekben: *könnyen alkalmazható az egyszerűen transzfektálható osztódó, adherens sejtek esetében! *nem adherens sejtekben viszont elektroporációt kell alkalmazni! *kémiai módosítás is segítheti az siRNS felvételt elsődleges és\vagy nem adherens sejtek esetében (kis molekulák) 3. Potenciális gyógyszer célpontok keresése: - cDNS microarray  Rengeteg adat (több ezer gén) Melyik a jó? siRNS  egy adott génnek a túlműködése kimutatható Gyógyszerek felkutatása!!!!

Hátrányok 4. Hátrányok: - Nem alkalmas nem kódoló régiókban történt mutációk azonosítására! - Nem alkalmas funkciónyeréses mutációk és domináns negatívok előállítására- sokszor kell a funkció teljes megértéséhez! - Soha nem tünteti el teljes mértékben a cél-mRNS-t! - Számos más siRNS vizsgálatára van szükség a megfelelő megtalálásához! - A RISC mennyisége sejttípusonként eltérő lehet  limitálhatja az RNSi hatékonyságát Hosszútávon, amikor minden génnek meg lesz az siRNS-e, lehetőség lesz a fenti problémák kiküszöbölésére!

VIII: siRNS alapú terápiás alkalmazások -Már alkalmaznak: Ribozimokat ODN  citomegalovírus fertőzésre (fomivirsen) - kémiailag módosított: TOXIKUS, KIS HATÉKONYSÁG -második generációs antiszensz konstrukciók  ÍGÉRETES siRNS  fiatalok, MÉG nincs klinikai alkalmazás  Számos eredmény egerekben: szepszis, vírus, hepatitis, oculáris neurovascularizáció elleni védelem!Injekció  máj, lép.  Kimutatták, hogy a Hepatitis-B virust közvetlenül képes megcélozni. ?Milyen módosítások növelnék a specificitást és a hatékonyságot?

Köszönöm a figyelmet!!