BIOKATALIZÁTOROK Fontos ipari enzimek

biokatalizátorok Fehérjék (enzimek), élő szervezetben a kémiai reakciókat katalizálják, de képesek az élő szervezeten kívül is aktívan működni Nukleinsavak (ribozimek), melyek elsősorban az RNS hidrolizisét katalizálják

„A titkos fegyver” Mit tudnak a mikroorganizmusok? a legkülönbözőbb szerves vegyületek átalakítására képesek enzimek konstitutív indukálható Biokonverzió, biotranszformáció = mikrobiális átalakítás

ismétlés Az enzimek fehérjék, különböző reakciókat katalizálnak megfelelő körülmények között működésük hőmérséklet és pH függő Az enzimek specifikusak: reakcióspecifikusak, ill. szubsztrátspecifikusak (vegyület, vagy vegyületcsoport adott reakcióját katalizálják), néhány enzim un. széles szubsztrát specifitással, bír, azaz többféle vegyület átalakítására képes Ipari, biotechnológiai jelentőségük óriási Számos enzim vesz részt biodegradációs folyamatokban

Enzimek, mint katalizátorok Reakciókhoz katalizátorokra van szükség enzimek Átmeneti állapot Eα katalizátor nélkül Szabad energia Eα katalizátorral Reaktáns (kiindulási állapot) A reakció szabadenergia változása Termék (végállapot) A reakció iránya kinetika (biokémia – Michelis-Menten kinetika)

Csoportosításuk International Union of Biochemistry (IUB) az enzimeket osztályozták (4 számmal jelölik) 1. Oxidoreduktázok: oxidációs-redukciós reakciók pl. alkohol dehidrogenáz, metán-monooxigenáz 2. Transzferázok: atomcsoport áthelyezés pl. aminotranszferázok, foszfotranszferázok 3. Hidrolázok: kovalens kötés hasítása víz belépésével pl. észterázok, lipázok, glükozidázok, proteázok, 4. Liázok: kötések hasítása nem hidrolitikus reakcióval pl. piruvát dekarboxiláz 5. Izomerázok: molekulán belüli átrendezés pl. fruktóz izomeráz, ribulóz foszfát epimeráz 6. Ligázok: szintetázok: két molekula kapcsolása, ATP-t igénylő karboxilázok: CO2 megkötését katal. pl. piruvát karboxiláz

biotechnológiai eljárások szempontjából legfontosabb tipusú enzimek és enzim-katalizált reakciók Számos enzim vesz részt biodegradációs folyamatokban Oxidáció: aromás gyűrű oxidatív hasítása, pl. oxigenázok hidroxiláció, pl. hidroxilázok heteroatomok oxidálása (pl. amino csoport nitro csoporttá) oldallánc oxidatív hasítása Redukció: karboxil csoport redukció, pl. dekarbozilázok heterocsoport redukció kettős kötés redukció Hidrolizis – hidrolázok -Depolimerizáció: fehérje polimerek hasítása pl. proteázok, cukor polimerek hasítása pl. amilázok, cellulázok lipidek bontása: lipázok, észterázok

kofaktorok Enzimek egy része képes önmagában hatékonyan katalizálni a reakciókat, míg másoknak segítő komponensek kellenek speciális kofaktorokat (pl. fémion, szerves vegyület) un. prosztetikus csoportokat (ha szorosan kapcsolódik az enzimhez) vagy koenzimeket (lazán kapcsolódó) használnak (ha a koenzimet eltávolítjuk, a maradék fehérjét apoenzimnek hívjuk, a teljes aktív enzimet holoenzimnek) A legtöbb mikroorganizmus képes a koenzimeket szintetizálni. Pl. NAD, NADP, FAD, citokrómok, ubiquinon, CoenzimA, ... meghatározott csoport átviteléért felelősek, főleg elektron transzfer, esetleg funkciós csoport transzfer (acil, metil,). Előnyük, hogy laza kapcsolódásuk az enzimhez lehetővé teszi, hogy több enzimnek is segítségére legyenek.

sokféleség Az evolúció során az egyes enzimek szerkezete, specificitása, aktivitása változott Kialakultak eltérő szekvenciájú, de hasonló feladatot ellátó enzimek Egyes enzimeket kódoló gének sokszorozódhattak az evolúció során, így ezek többszörösen is előfordulnak a genomban. Előfordulhat, hogy ezután egymástól függetlenül némileg módosultak, így specifitásuk, aktivitásuk is

A különböző (ipari) enzimek eladási aránya

PROTEÁZOK Minden élő szervezetben Növényi proteázok: pl. Papain (Carica papaya) Bromelain Keratinázok Állati proteázok: pl. Tripszin Kimotripszin Pepszin Renin Mikrobiális proteázok – nagyon sokféle Bakteriális Gomba eredetű Vírusok által termelt

PROTEÁZOK Általánosan elterjedtek Extracelluláris, intracelluláris proteázok Az extracelluláris proteázok ritkán konstitutívan termelődnek, általában akkor indukálódnak, ha éhezik a sejt Fontos ipari enzimek (mosószer-, tejipar)

PROTEÁZOK Csoportosításuk: I. Exo-, endopeptidázok II. pH optimum alapján 1. Alkalikus 2. Semleges 3. Savanyú proteázok III. aktív centrumban lévő aminosavak/fémek szerint: 1. Szerin- I, II pl. Chymotrypsin, trypsin; subtilisin 2. Cisztein- pl. papain 3. Aszparagin- pl.penicillopepsin, renin 4. Metallo- I., II. (stb.) prtoeázok pl. bovine carboxypeptidase A; thermolysin

Proteázok specifitása Enzim: Hasítás a peptid láncban: Tripszin -Lys(v. Arg)ˇ---- Kimotripszin, szubtilizin -Trp(v. Tyr,Phe,Leu)ˇ---- Staphylococcus V8 proteáz -Asp(v. Glu)ˇ---- Papain -Phe(v. Val,Leu)-Xaaˇ---- Termolizin ---ˇLeu(v. Phe)------ Pepszin -Phe (v. Tyr,Leu)ˇTrp(v. Phe,Tyr)

Fontosabb ipari alkalmazásuk Savanyú proteázok: sajtgyártás során (renninszerű p.), orvosi gyakorlatban (pepszinszerű p.), sütőiparban Semleges proteázok – viszonylag instabilak: bőriparban (kőmosott farmer, bőr puhítás) élelmiszeriparban Alkalikus proteázok – stabilak erősen lúgos környe- zetben és magas hőm-en: mosószeriparban A legismertebb proteáz termelők pl. Bacillus fajok

Amilázok I Amilázok hőstabilak, alacsony pH-n (<6,0) is aktívak, könnyen előállíthatók a-amiláz (α-1,4-D-glükán-glükonohidroláz): keményítő, glikogén, és rokon poliszaharidok α-1,4-glikozidos kötéseinek hasítása három doménből álló endoenzim, véletlenszerűen hasítja a polimert, oligoszaharidok keletk., a hosszabb láncokat könnyebben bontja extracellulárisan fejti ki hatását, termék gátlás (glükóz) Ca igény az enzim aktív térszerkezetének kialakításához Hasznosítása: alkohol termelés, keményítő bontás Termelő fajok: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, B. licheniformis, de megtalálható a nyálban, hasnyálmirigy is termeli, növényekben is A kül. eredetű enzimek sok tul-ban hasonlóak, de el is térnek egymástól (pH, hőm. opt) b-amiláz: nem redukáló láncvégekről hasít le maltózt Stabilabb, nincs Ca igénye Egyes Streptomyces, Pseudomonas fajokban, növényekben

Amilázok II Glükoamiláz: Pullulanáz (izoamiláz): elágazásoknál hasít, de mindhárom féle hasítrásra képes Termelő fajok: Aspergillus niger Pullulanáz (izoamiláz): amilopektin elágazódásainál, az a-1,6-kötéseit hasítja Termelő fajok: Pullularia pullulans, Bacillus acidopullolyticus

Keményítő szerkezete, enzimatikus hasítása a-amiláz oligoszacharidokra (dextrinek) bontja b-amiláz láncvégi nem redukáló csoportoknál hasít le maltózokat Glükoamiláz a keményítőben meglévő mindhárom féle kötést képes bontani

cellulázok Enzimrendszer: endo-, exocellulázok, b-glükozidázok Extracelluláris, ill. sejtek felszínén Termelő fajok (baktériumok, eukarióta gombák): Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor, Cellulomonas fajok Endocelluláz: endoglukanáz random hasít oligomerekre Exocelluláz: exoglukanáz láncvégről dimereket – cellobióz- hasít - b-glükozidáz: cellobiáz cellobiózt kettéhasítja glükózokra Hasznosítás: bioüzemanyaggyártásban: bioetanol, biogáz

Cellulóz és hasító enzimei

Cellulóz bontó mikroorganizmusok 1970-es évek: olajválság megújuló energiaforrások kutatása (cellulózból etanol és más hasznos vegyület termelése) Trichoderma gombák - egyedi enzimek dolgoznak egymással szinergizmusban (aeroboknál általában igaz) pl.: Trichoderma reesei termofil Clostridiumok (Gram pozitív, obligát anaerob) pl.: C. thermocellum, C. cellulolyticus - cellulóz kötő faktorok (cellulose binding factor = CBF)

celluloszóma sok van a sejt felszínén és extracellulárisan, a táptalajban is nagy molekula, kb. 2000 kDa extracellulárisan rakódik össze nagy celluláz-aktivitás az enzimösszetételt valószínűleg a szubsztrát is befolyásolja extracelluláris szupramolekuláris komplex, ami hatékonyan bontja a cellulózt

Miért előnyös a celluloszóma? a csapatmunka hatásosabb kevesebb enzim elég ugyanannyi kristályos cellulóz hidrolizálásához (szinergizmus) a szabad enzim könnyebben eldiffundálhat a C. thermocellum (celluloszóma) hatékonyabb a Trichoderma reeseinél (egyedi enzimek) mesterséges celluloszómák: mesterséges polimerek lebontása (nylon, poliészter, műanyagok) válogatott enzimek meghatározott helyre beépítve

Nem celluloszómás cellulázok A termelő fajok gyakran több hasonló funkciójú cellulázt termelnek, melyek specifitása némileg eltér (a polimert más-más helyen hasítják) Pl. T. reesei két exoglükanáz, 5 endoglükanáz. Cellulomonas sp. 6 endoglükanáz Ezek az enzimek rendelkeznek cellulóz kötő doménnel Thermobifida fusca faj érdekessége, hogy van egy olyan glükanáza, mely endo-, és exo aktivitással is bír

Észterázok, lipázok Széles körben elterjedtek a természetben Stabil enzimek, széles pH és hőmérséklet tartomány, stabilak szerves oldószerekben Észterkötések hidrolizise: glicerinészterekből zsírsav és glicerid Extracelluláris, indukálható enzimek, ált. gyengén lúgos környezetben, Ca ionok pozitív hatás (zsírsavak Ca sóként kicsapódnak, nincs termékgátlás), N forrás is befolyásolja termelődésüket Hasznosítás: gyógyászat, élelmiszeripar (pl. sajtgyártás), tisztítószerek, bioüzemanyagok (biodízel) Termelő fajok: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, egyes élesztőgombák, és Lactobacillus, Micrococcus baktériumok,emlős hasnyálmirigy, máj, magvakban

Aerob lebontási folyamatokban a központi szerepet az oxigenázok játszák Alkánok, aromás vegyületek oxidációját katalizálják, melynek eredménye alkoholok, aldehidek, epoxidok, karboxilsavak Ipari biotechnológiai jelentőség

OXIGENÁZOK Működésükhöz molekuláris oxigénre, és kofaktorokra van szükség szerkezetükben, működésükben, kofaktor igényükben eltérnek Általában több alegységből állnak Az általuk katalizált reakció energianyerő, de a keletkező energiát a sejt a szubsztrát szerkezet destabilizálására fordítja 1955 Osamuri Hayaishi - felfedezi az oxigenáz enzimeket dioxigenázok H. S. Mason - felfedezi a fenoláz enzimet monooxigenázok 1965- Irwin Gunsalus - citokróm P450 bakt. monoox. 1970 David Gibson - aromás szénhidrogén dioxigenázok - lebontó útvonalak tanulmányozása 1980- sok kutatócsoport - lebontási útvonalak feltérképezése Ananda Chakrabarty - katabolikus plazmid transzfer Pseudomonas törzsek között

Az aromás gyűrű szerkezet lebontási útvonalában a Prokarióta és Eukarióta oxigenázok katalizálta reakciók első lépcsője

OXIGENÁZOK Nagyon eltérő szervezetekből származnak, mégis számos közös tulajdonságot fedezhetünk fel szerkezetükben, reakció mechanizmusukban Az oxigenázokat két nagy csoportba sorolják: monooxigenázok, dioxigenázok Az enzimreakció során a NAD(P)H-t az enzimen levő FAD oxidálja, a FADH2 kofaktorhoz kapcsolódik az O2, és egy reaktív hidroxiperoxiflavin tartalmú fehérje képződik. Majd egy átmeneti köztiterméken keresztül hidroxilálja az aromás gyűrűt.

OXIGENÁZOK Számos szervezetben megtalálhatók Gyakran plazmidon kódoltak Szerkezetileg lehetnek hasonlóak, miközben funkciójukban eltérnek Összefüggés a szubsztrát spektrum nagysága és a hatékonyság között (sok szubsztrátot elfogadó enzimek hatékonysága gyakran gyengébb) Ipari hasznosítás –módosított enzimek: jobb hatékonyság, nagyobb szubsztrát spektrum

I. Monooxigenázok Az O2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába, az oxigén másik atomja redukálódik és vízmolekulává alakul. Elektrondonorként NAD(P)H-t igényel, vagy magát a szubsztrátot használja Többségük egykomponensű enzim, de előfordul multikomponensű is pl. fenol-, toluol monooxigenáz Csoportosításuk: 1. aromás gyűrű monooxigenázok 2. alkil csoport hidroxilázok 3. citokróm P-450 család 4. aromás aminosav hidroxilázok (Eukariótákban)

II. Dioxigenázok A dioxigenázok az O2 mindkét atomját a szubsztrátba építik. Csoportosításuk: 1. Az aromás gyűrűre oxigént építő - mindig orto pozícióban dihidroxilálnak, katekol származék keletkezik - funkcionálisan két rész: egy hidroxiláz komponens és egy e- transzport komponens - A reakcióhoz NAD(P)H-ra is szükség van. 2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok - A gyűrűt hasító dioxigenázok az oxigén molekula két atomját úgy építik be a katekol származékokba, hogy közben a gyűrű felnyitását is katalizálják, külső reduktánsra nincs szükség - 2 v. több –OH csoportot tartalmazó aromás gyűrűk a szubsztrátjaik

2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok II. Dioxigenázok 2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok Ha a 2 –OH csop. egymáshoz visz. helyzete orto, akkor több pozícióban is hasíthatják a gyűrűt: megkülönböztetünk 2,3-; 3,4-; 4,5-gyűrű hasító dioxigenázokat: a, 2,3-; 4,5-dioxigenázok a katekolokat extradiol/meta, b, 3,4-dioxigenázok intradiol/orto helyzetben hasítják - Ha a 2 –OH csop. egymáshoz visz. helyzete para pl. gentizát esetén a karboxil csoport és a mellette lévő hidroxil csoport között hasít

2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok II. Dioxigenázok 2. Az aromás gyűrű hasításában résztvevő dioxigenázok NADH+H+ NAD+ orto/intradiol hasító dioxigenázok a két hidroxil csoport között nyitják a gyűrűt, mukonát intermedieren keresztül szukcinát keletkezik meta/extradiol hasító dioxigenázok a két hidroxil csoport mellett hasítanak, hidroxi-szemialdehid intermedieren keresztül piruvát keletkezik O2 YH