3.  A T sejtek ontogenezise: az antigén-független fázis  A timociták szelekciója

A T-sejt érés és szabályozásának vizsgálati stratégiái Gén-manipulált állat (egér) modellek  A timusz szelekciós és egyéb T sejt fejlődési folyamatainak követése normál sejteken nehéz: a TcR-ok kis %-a reagál csak egy ‘különleges’ MHC/peptid komplex’-el 1.) “TcR transzgén” egerek - szelektivitás - egér embrióba funkcionálisan átrendeződött TcR αβ géneket juttatnak, melyek adott MHC és antigén-peptid specificitással rendelkeznek kis α lánc allél kizárás: trg β/endo α TcR tenyésztés RAG1/2 - / - knockout egerekkel 2.) Gén knockout, mutáns egerek adott gének célzott kiütése (KO) vagy domináns negatív mutációja (DN) rekombinációs gének: RAG-1/ RAG-2 -/- sejtfelszíni receptor gének: MHC-I, MHC-II, TcR, CD4, CD8, stb... szignál molekula / TRF gének: pl.Lck, Fyn, ZAP70, JAK-3, Ikarosz, stb...

3.) Speciális kiméra egerek valamely gén hiányzik (KO) - egy transzgén (Trg) expresszálva van Transzgén egerek x tenyésztése knockout vonalakkal és az utódok genetikai jellemzők alapján történő szelektálása pl. TcR transzgén egér valamilyen gén knockout háttérrel: β2m-deficiens, adott MHC-I-re korlátozott TcR-transzgén egér

4.) In vitro fejlődés modellek: Stróma sejt ko-kultúra, FTOC, RTOC megfelelő tímusz stróma sejtek (OPD: MCSF-/- ; Jagged+ , vagy OPD-DL1 (Delta-like1+) és progenitor sejtek tenyésztése közös kultúrában

Tímusz szubkapszuláris/ kortikális zóna TN1/TLP CLP GATA-3 Notch-1 PHSC PU.1 Ikaros TN1/TLP CLP CLP GATA-3 Notch-1 Pax5 IL-7Rα B sejt Tímusz

• • • A PHSC CLP elkötelezettséget szabályozó Ikaros TRF Limfoid sejt-specifikus, “Zinc-finger” típusú transzkripciós faktor családot kódol (6 izoforma ismert) • • Az izoformák 1 azonos C terminális domén és 2 zinc-finger dimerizációs domén (4 zinc-finger DNS-kötő domén kombinációjából) csak az 1, 2, 3 izoformák kötődnek egy konszenzus GGGA DNS core motívumhoz • Az Ikaros széles expressziós mintázatot mutat: peteburok (E8), magzati és felnőtt timociták, érett T és B sejtek, NK sejtek

• • • Az Ikaros TRF T-sejt érést szabályozó hatásai: a DNS-kötő 1-3 zinc-finger régió célzott delétiója Az Ikaros-mutáns egerekben : • hiányoznak a T, B és NK sejtek, valamint ezek progenitorai ! • egyéb hematopoietikus fejlődési vonalak változatlanok • egy stabil negatív Ikaros forma expresszálódik, mely képes egyéb Ikaros-rokon fehérjékkel ( pl. Aiolos) dimerizálódni, de nem képes a DNS-hez kötődni !! Az Ikaros expressziója ill. aktív funkciója alapvetően fontos a CLP differenciálódásában és túlélésében Az Ikaros gén a limfoid sejtfejlődési vonal egyik legkorábbi transzkripciós szintű ellenőrzési pontja

• • • GATA-3: csak T és NK sejteken található ! A GATA-3 TRF a CLP-TN1 átmenet egyik legfontosabb szabályozója • A GATA család 6 tagból áll, melyek egy nagyon hasonló, 2 evolúciósan konzervált Zinc-finger doménből felépülő DNS-kötő domént tartalmaznak. A GATA fehérjék kötődnek konszenzus GATA szekvenciához és nem-konszenzus GATA motívumokhoz egyaránt GATA- 1,2,3 alcsalád GATA- 4,5,6 alcsalád hematopoietikus sejtek széles körén expresszált fejlődő szív, bélrendszer, sima izom GATA-1 : erythroid differenciálódás GATA-2: PHSC fejlődés/túlélés GATA-3: T sejt fejlődés GATA-3: • csak T és NK sejteken található ! • konszenzus GATA-3 kötőhelyek: TcR α, β, δ gének, CD8α gén

A GATA-3 gén szerepének igazolása: RAG2 komplementációs rendszer és GATA-3-/ - embrionális őssejtek kombinációja • RAG2 -/- egér GATA-3 -/- embrionális őssejt (ESC) • kiméra egér RAG2 -/ - blasztocisztába GATA-3 -/ - ESC injektálva mivel a B és T sejtek RAG nélkül nem fejlődnek, így a kiméra egérben az összes B és T sejt GATA-3 deficiens ES sejtből származik •

A GATA-3 gén szerepe II. - a kiméra egérben normál B sejt populáció jelent meg - a tímuszból hiányoztak a DP és SP T sejtek és az érett perifériás T sejtek is a nyirokszervekből  A GATA-3 esszenciális a TN/DP timociták kifejlődéséhez és túléléséhez A GATA-3 a T-sejt irányba elkötelezett sejtek fejlődésének legkorábbi transzkripciós szabályozó faktora (pontos mechanizmus nem ismert)

γδ T-sejtek A TN1-TN3 fejlődési állapotok és szabályozásuk… TN1/TLP TN2/pro-T TN3/pre-T IL-7, IL-7Rα E2A Hes1, HEB RAG 1,2 CD25 – CD44 ++ CD25 + CD44 + CD25 + CD44 - TcRβ, pTcRα Tímusz SCF, IL-7 (target: TcRγ gén) TSLP citokin E2A (Id) TRF-ok β (α) génátrendeződés

TN1- TN2 – TN3 – TN4 – ISP - DP E2A (Id) HEB γ,δ génátrendeződés és expresszió kontrollja pre-TcRα gén expresszió kontrollja • E2A -/- Erőteljes γδ-T-sejt hiány (20-40x), 5x αβ-T-sejt hiány HEB -/- nincs γδ-T-sejt hiány, 5-10x αβ-T-sejt hiány Az E2A a T-sejt érés γδ-T-sejt vonalának egyik specifikus szabályozója

 E és Id transzkripciós faktorok szabályozó funkciója a TN T-sejt érési fázisokban “helix-loop-helix” (HLH) család transzkripciós faktorok: E2A, HEB E-box: CD4-, TcRβ-enhancerek, CD4-silencer Id géntermékek: az E-proteinek DNS-kötését regulálják, gátolván az E-protein aktivitást, saját DNS kötőhelyük nincs T sejt-specifikus gén E protein: dimerizáció E-box aktivált transzkripció E- Id heterodimer: gátolt transzkripció Az Id3 az E2A/HEB DNS kötésének down-regulációja révén szabályozza az SP T sejtek termelődését a tímuszban.  E2A -/- egerek (HEB -/-) - A timocita érés részleges blokkja DN fázisban - DP timociták

lefolyása, főbb mechanizmusai A TCR láncok génjeinek átrendeződése: A szomatikus génrekombináció lefolyása, főbb mechanizmusai

A T sejtek antigénfelismerő receptorának (TcR) szerkezeti felépítése (humán) 45-60 kD 40-60 kD (γ) (δ) CD3 α β v v CD3 δ ε γ ε c c ζ ζ s-s S-S 45-60 kD 40-50 kD 25-28 kD, ser-P 20 kD, ser-P 20 kD, ser-P ITAM 20 kD, ser-P 16 kD, tyr-P (90% gyakoriság) humán 9., egér 11. kromoszómán

Az emberi TCR antigénkötő láncait kódoló gének V,J,D és C gén- szegmentumok lokusz: 50 –100 V,1 D, 6 J, 1 C gén 75 V, 60 J gén között: δ lokusz

RAG1 és RAG2 enzimek szerepe a génátrendeződésben Minden rekombinálódó V, D és J génszegmentumot nem kódoló régiók határolnak: ezek egy konzervált heptamérből és nonamerből állnak, melyeket egy 12 vagy 23 bázispárból álló spacer választ el egymástól ezek a Rekombinációs Szignál Szekvenciák (RSS), ezekhez kötődnek a RAG1,2 enzimek „coding joint” (kódoló szakasz) „signal-joint”

A „kapcsolódási diverzitás” kialakulása és a főszereplők: 1.) RSS- RAG1/2 kapcsolódás és hasítások, a ‘hairpin-loop’ kialakulása 2.) DNA-PK (DNS függő protein kináz) kapcsolódása a hasított végekhez és repair enzimek (Artemis nukleáz; XRCC4 (X-ray repair crosscomplementing factor4); Cernunnos DNA polymerase, ...) foszforiláció-függő toborzása a kapcsolódási helyekhez. 3.) A repair enzimek a DNA-PK segítségével „összeillesztik a két DNS szálvéget, P-nukleotid addíció, és ide toborozzák a TdT-t (terminális dezoxinukleotidil transzferázt), mely random N-nukleotid addíciót hajt végre. 4.) Végül a DNS ligázok fejezik be a kapcsolat kialakítást a kódoló (V)DJ joint géntermékben.

DIVERZITÁS! A TCR α és β láncok szomatikus rekombinációja és processzálása teljes génkészlet: 1015 effektív gén -termékkészlet: ~107 DIVERZITÁS!

☺ ☺  Az IL-7 citokin szignál és a timocita érés IL-7 IL-7 IL-7 α Stróma sejt IL-7 IL-7 IL-7 α IL-7R ---------------------------------------------------------------------- γc membrán ---------------------------------------------------------------------- JAK-3 ? PI-3K STAT-5 STAT-5 P sejtmag ☺ target gén γc jel-függő Bcl-2 indukció részleges anti-apoptotikus szignál  IL-7 -/- timocitákban : Bcl-2 ☺ Az IL-7 szignál szükséges a TcRγ gén hozzáférhetőségének/ aktivációjának indukálásához

A strómális eredetű citokinek jelentősége erősen csökkent timocita szám TN1-TN2 hiányzik αβ T-sejtek csökkent száma, γδ T-sejtek teljes hiánya, ami TcRγ-trg egérben részlegesen helyreáll • IL-7-/- • IL-7-/- ,γC -/- van egy részleges TCRγ-gén átrendeződés ! (?) Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP): IL-7-hez hasonló szignálok az IL-7Rα-t (és nem a γC-t) használja receptorként IL-7 jel hiányában a TcRγ lókusz hozzáférhetetlen és inaktív: Nincs RAG1,2-indukált hasítás a Jγ1 génben

A pre-T sejt stádium CD3,Lck/Fyn, ZAP-70/Syk, LAT, SLP76 A NOTCH szignál egy fontos kiegészítő szignál a pre-T sejtek túléséhez, a rekombináció befejeződéséhez ! CD3,Lck/Fyn, ZAP-70/Syk, LAT, SLP76 Beta-lánc átrendeződés (allél kizárás); RAG1,2 alfa-lánc átrendeződés DP proliferáció, túlélés (IL-7 citokin + Notch is !)

esszenciális szerepe ezen stádium túlélésében A pre-TcR jelátvitel: a lipid raftok és a Notch-szignál esszenciális szerepe ezen stádium túlélésében TcRβ/pre TCRα TcR αβ, CD4+CD8+ timocita γδ T sejt pre T sejt palmitoiláció raft “túlélési”, differenc. szignál Ligand ? + NOTCH

sorrend: γδ-TcR, αβ-TcR A TN1- TN4 - ISP – DP érési folyamat során: a TN2-TN4 fázisban lezajlik a TcR-lánc gének (γ,δ,β,α) átrendeződése (szomatikus rekombinációja) szabályozás: - RAG 1, 2 génexpresszió: feltétel - IL-7, IL-7Rα expresszió és jelátvitel kritikus - bHLH TRF-ok (E2A, HEB, Id): kritikus sorrend: γδ-TcR, αβ-TcR

Tímusz TN3/pre-T TN4 ISP DP transzkripciós faktorok CD3ζ CD25 - CD44 - TcRαβ, CD3(L), CD8(L) CD25 - CD44 - TcRαβ, CD3 CD4,CD8 CD25 + CD44 - TcRβ, pTcRα CD3 CD25 - CD44 - TcRβ, pTcRα CD3 pTα/TcRβ–szignál/Notch1 (Lck/Fyn, CD3, ZAP-70/Syk, LAT, SLP76) TCF1/LEF1 (HEB) transzkripciós faktorok RAG 1,2 IL-7 TCF1, LEF1, SOX4 transzkripciós faktorok CD3ζ

TCF-1 (T sejt faktor-1) és LEF-1 (lymphoid enhancer-binding faktor 1) transzkripciós faktorok • A HMG-box DNS-kötő fehérjecsalád két erősen homológ tagja • A TCF-1 DNS kötőhelyei: - CD3ε gén enhancer - TcRα, TcRβ and TcRδ enhancer-ek • A LEF-1 faktor: - pre-B sejtekből izolálták - ugyancsak kötődik a TcRα gén konszenzus enhancer motívumához és azt transzaktiválja • A TCF-1 és LEF-1 expressziója: - széleskörű: pl. fejlődő végtag-, fog-csirák, urogenitális gerinc, tüdő, tímusz - születés után a limfocitákra korlátozódik - átfedő expresszió a T-sejt alpopulációkon a DN-től az érett SP T-sejt állapotig a TCF-1 korábban expresszálódik a DN populációban és expressziója magasabb mint a LEF-1-é A B-sejt fejlődés pro-B/ pre-B érési fázisában csak a LEF-1 expresszálódik A TCF-1 és LEF-1 kötődése egyaránt DNS hajlást (bending) idéz elő elősegíti a komplex enhancer-eken (pl. TcRα, TcRβ) a különböző transzkripciós faktorok csoportosulását

A timociták ontogenezisének TN-DP szakaszát szabályozó fontosabb transzkripciós faktorok CD4+ CD44+ CD25 - CD44 - CD25+ IM CD8 + CD8+ TN ISP DP SP GATA-3 RAG-1 RAG-2 TCF-1 LEF-1 Sox4 (IL-7/IL-7R)

Hogyan szelektálódik ez a nagy, diverz DP T-sejt populáció ? apoptózis (~ 90%)

Sir Macfarlane BURNET: “klónszelekciós elmélet” A timociták szelekciója Sir Macfarlane BURNET: “klónszelekciós elmélet” Nobel Lecture December 12, 1960.: „Immunological Recognition of Self” ☺ az antigénnel való találkozást megelőzően kialakul egy nagy, diverz, redundáns antigén-specifikus receptor készlet (populáció) elsődleges nyirokszervekben: klón-deletio/anergia (populáció szelekció)  saját struktúrák iránti tolerancia ☺ másodlagos nyirokszervekben: szelektív klonális expanzió (antigén inger, differenciált sejtaktiváció) fajlagos immunválasz Újabb kiegészítés: A receptor készlet kialakulása a központi nyirokszervekben (“antigén-független”), de az Ag-el való találkozás után (perifériás nyirokszervek) is módosulhat pl. antigén-függő receptor revízió, újraszerkesztés (?)

Szelekciós környezet/kölcsönhatások: Stróma steroid sex hormon (ösztrogen, tesztoszteron) IL-7,IL-6, TSLP, ... Notch ligand (Jagged, Delta-1,...) ? IM DP timocita CD8 CD4 TcR CD3 DC MHC-I MHC-II c/mTEC MHC-I MHC-II ? neuropeptidek, szimpatikus és paraszimpatikus beidegződés/ szignálok Glukokortikoidok (stróma/stressz) Purinerg szignálok (sejtpusztulás, lokális)

A „Notch-szignál” a T sejt fejlődés egyik ‘univerzális szabályozója’ A ligandumok a kortikális és medulláris epitél sejteken ill. a BM DC-ken: Jagged-1, Jagged-2, Delta-L1/2 A receptor fejlődésben levő T sejteken: Notch-1 receptor Szabályozzák: - a B vs. T limfocita elkötelezettséget - a korai antigénfüggetlen fejlődési stádiumokat - a szelekciós és CD4 vs. CD8 differenciálódási folyamatokat

☺     A timociták szelekciója + szelekció DP pro-T DP + szelekció CD8+ CD4+ - szelekció ~ 85-90% ☺  precíz molekuláris felismerési folyamatok (TcR-antigén, TcR-MHC, MHC-peptid)  APC-T sejt kölcsönhatás (antigén denzitás, adhéziós molekulakészlet)  pozitív és negatív jelek átvitelére alkalmas jelátvivő molekulák (kaszkádok, cross-talk, szabályozó elemek)  A sejtciklust és transzkripciót szabályozó faktorok, lokális és külső (pl. idegrendszeri) eredetű mediátorok (pl. ext. ATP, Ad, glukokortikoidok, stressz-faktorok)