Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában Bacillus subtilis elsőként (az E.coli után) http://www.danforthcenter.org/Cells/images/

Miért termeltessünk heterológ fehérjét Bacillus subtilis-ban? Sok fehérje kiválasztása a tápoldatba, nagy mennyiségben ! SZEKRÉCIÓ! 2) Nincs patogén törzs 3) Jól ismert, nagy térfogatú ipari fermentációk Hátrányok: 1) Korlátozott számú vektor 2) Az optimalizált vektor rendszerek védettek 3) Nem glikozilez 4) Sok proteáz – terméket tönkre teszi

Optimalizált B. subtilis “Cell Factory”? A B. subtilis genom 12% -ának deléciója, nincs rá szükség a növekedéshez A felszabaduló energia a termék-képződésre fordítódhat. x x x x x

2) A Bacillus subtilis Sec-függő és Sec-független szekréciós útvonalai alaposan tanulmányozhatók és valószínűleg javíthatók is A szekréciós útvonal utolsó lépései problémásak, amelyek citoplazma membránon történő transzlokációt követik. a) A SipS (SPáz) túltermeltetése segít A későbbi proteolízis a fő probléma. A transzlokálódott fehérjék másodlagos szerkezete a sejtfal környezetben alakul aktívvá és proteáz rezisztenssé. b) ezt pl. a PrsA, a tiol-diszulfid reduktázok és kationok (pl. Ca2+ és Fe3+) katalizálják.

Néhány termék Enzimek Finom vegyszerek Poliszacharidok Proteázok Amilázok Finom vegyszerek Aminosavak vitaminok Poliszacharidok hialuronsav

Az expressziós kazetta

Bacillus gazdák Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Szekréció jó amyE, nprE, aprE, spoIIAC, srfC deléciók Természetes kompetencia Bacillus licheniformis Kis extracelluláris proteáz aktivitás, spo Elektroporáció, konjugáció, protoplaszt

Géncsere

Törzsfejlesztés habzás Surfactin: felületaktív lipopeptid

Pigment mentes törzs

Ilyen egyszerű a dolog? Valahol mindig van valami probléma

Transzkripciónál és az mRNS telítés

A termelő törzs: erős promóter és nagy kópiaszám (a régi módi)

Az mRNS telítés lehetőségei

Erősebb promóterek: a tandem promóter/cry3A stabilizáló technika

A termelő törzs (új megoldás) Inzerció több, nem kapcsolt lókuszba 100%-os stabilitás mRNS telítés Marker mentes termelő törzs

Maximális termelés egy kópiás expressziós kazettáról

Hialuronsav termelés B. subtilis-szel

Hialuronsav termelés Streptococcus törzsekkel

Hialuronsav termelés B. subtilis-szel, mesterséges operon

Operon a kromoszómába

EUKARIÓTA expressziós rendszerek Élesztő Baculovírus Emlős Posztszintetikus módosítások

Expresszó élesztőben Autonóm replikálódó vektorok -> shuttle vektorok

Integrációs vektorok jobb stabilitás, jobb termelés

Hatékony kiválasztás Ha toxikus a fehérje Ha S-S hidak kellenek S. cerevisiae hiperglikozilál P. pastoris nem

P. pastoris

Rovar sejtben majdnem emlős minőség Baculovírus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)

EMLŐS sejt