DNS replikáció Szükséges funkciók Iniciáció Kell egy origóhoz kötődő fehérje (DnaA E. coli) Majd összeáll a helikáz komplex az origónál Baktériumoknak egy origó Néhány Archea két origójú, de hogy mindkettőt egyszerre használják-e? A hélix szálainak szétválasztása DNS helikáz Topoizomeráz, hogy megszüntesse az extra szupercsavarokat Topoizomeráz, hogy elkészítse az új DNS-en a szupercsavarokat

Replikáció, folyt. Az egyszálú DNS-t stabilizálja az SSB (SSB= single strand binding protein) A régi információ másolása új szálra Primer a DNS polimeráznak Primer eltávolítása

A replikációs villa A szintézis mindig 5¢®3¢ irányba A topoizomeráz nincs feltüntetve

Primer eltávolítása Alapvetően egy javító művelet A DNS polimeráz I végzi 3¢®5¢ exonukleáz aktivitás 5¢®3¢ polimeráz aktivitás

Az Okazaki fragmentumok sorsa 3. 2. 1. Okazaki fragmentumok DNS RNS Pol I a fragmentumok közötti nick-hez kapcsolódik Primer rövidül Az előző fragmentum nő Nick-ek maradnak Végül minden fragmentum tisztán DNS Nick-eket a DNS ligáz zárja

A replikáció iniciációja Specifikus helyen kezdődik oriC Primer szintézis kell oriC védett a véletlen transzkripciótól E. coli-ban az iniciációhoz szükséges a DnaA fehérje és a transzkripció iniciációja a közeli mioC promóterről

oriC : konzervált szerkezet E. coli Ps. putida B. subtilis M. luteus

A replikációs üzem Az oriC vándorlása biztosítja a kromoszóma DNS-ek szegregációját Bacillus subtilis

Replikáció terminációja A folyamat túlmegy a végponton Átfedő fragmentumok képződnek A gyűrűs molekulát rekombináció állítja helyre E. coli

Lehetséges terminációs hibák

Restrikció és modifikáció Restrikciós enzimek típusai I. Egy fehérje, restrikció és modifikáció is (EcoK) Ha a DNS egyáltalán nem metilezett, a kötőhelytől néhyány kb-ra vág Ha a DNS hemimetilált, akkor módosítja azt II. két fehérje molekula A restrikciós enzim a felismerő helynél/ben vág Módosított vagy módosítatlan DNS-t is vághatja ( az enzimre jellemző specifikussággal) Génsebészetben használatosak

Restrikció, folyt. III. A restrikciós enzim a felismerő hely egyik oldalán meghatározott távolságra vág Izoschizomerek azok az enzimek, amelye különböző mikroorganizmusokból származnak és ugyanaz a felismerő helyük

RM, folyt A restrikciós enzimeken alapul a génsebészetRestriction enzymes are basis of genetic engineering Átellenes vágás Minden fragmentum vágott végei azonosak AC TG Felismerő hely Minden fragmentum, bárhonnan származik is a DNS Bármelyik másik fragmentumhoz illeszkedik

Elektroforézis Általában agaróz (PAGE) Különlegesen tiszta agar-agar DNS festése fluoreszkáló festékkel (EBr) Mi a fluoreszcencia? Egy hullámhosszúságú fotonok abszorbciója és más hullámhosszú fotonok emissziója Ebben az esetben besugárzás közeli UV-val és vörös fénnyel világít

Agaróz gél Vándorlás DNS minta felvitel itt Pozitív elektróda itt Negatív elktróda itt Kis fragmen- tumok ezen a végen

Southern Blot Kérdés: Hogyan tudjuk megmondani, hogy melyik fragmentumban van az általunk keresett szekvencia? Fragmentumok vizsgálata A keresett DNS szekvenciánkkal komplementer, jelölt próba RNS, vagy DNS kell DNS átszivatása (blot) a gélből szilárd hordozóra (membrán) DNS denaturálása Egyszálúsított jelölt próba lötyögtetése a hordozó fölött. Mosás.

Southern Blot, folyt. A megkötött próba kimutatása Kereső, próba DNS-t jelölhetjük izotóppal autoradiográfia Próbát jelölhetjük biotinnal A biotin nagyon erősen kötődik avidinhez, vagy streptavidinhez Avidint egy enzimhez kötjük. Az enzim reagál a szubsztráttal és színes terméket kapunk. Ha DNS-t mutatunk ki, akkor Sothern blot, ha RNS-t, akkor Northern blot

Southern Blot Nem emésztődött DNS Csak néhány sáv mutat radioaktivitást

DNS szekvenálás A legnépszerűbb Fred Sanger, a DNS replikáción alapuló módszere A DNS replikáció onnan indul, ahol primert talál Addig megy, míg terminátort nem talál, vagy lineáris DNS-nél a molekula végéig, vagy ha hiányzik a 3’-hidroxil csoport dNTP mix+kis mennyiségű specifikus ddNTP Amikor a ddNTP beépül a szintézis befejeződik A fragmentum első bázisa a primeré, utolsó bázisa a ddNTP

Didezoxi bázis (ddNTP) 5¢ szén 5¢ szén 3¢ szén Nincs OH csoport

Szekvencia analízis A fragmentumok elválasztása méret szerint Elektroforézis Akrilamid gél Ma már automatizált a szekvencia analízis, kézi szekvenálás speciális esetekben

Polimeráz láncreakció (PCR) Polymerase Chain Reaction A DNS egy régiójának amplifikálására alkalmas módszer Templát DNS+primerek+dNTPmix+DNS polimeráz 3¢ A primerek meghatározzák az amplifikálandó régiót Templát DNS denaturálása hővel + primerek 3¢ Alacsonyabb hőmérsékleten a primerek megtalálják a helyüket

PCR, folyt. Replikácó túlhalad a másik primer kötőhelyén 5¢ 3¢ Újra denaturáljuk a DNS-t melegítéssel 3¢ Visszahűtés, primerek újra kötődnek Új DNS szintézise túl a másik primer helyen, vagy a molekula végéig Minden ciklusban a specifikus fragmentum megduplázódik.

PCR, folyt. A normális polimeráz magas hőmérsékleten inaktíválódik Extremofileknek hőstabil DNS polimeráza van. Termofil mikroorganizmusok Thermus aquaticus A restrikciós enzimek analógiájára: Taq polimeráz És még sok másik.