Globális tesztek a hemosztázis vizsgálatában Dr. Várnai Katalin Semmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest) 2013.05.30.

Globális tesztek A hemosztázis rutin tesztjei a diagnosztikus lépések alapjait képezik. A vizsgálatok közege thrombocyta szegény vagy thrombocyta mentes plazma, így a hemosztázis elemeinek komplex hálózatát nem érzékelik. A mérések végpontjánál a trombin kb. 5% keletkezik. Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). A rutin tesztek érzékenysége a hiperkoaguláció irányában is elégtelenek. A prokoaguláns aktivitású mikropartikulák mérése segíthet ezen állapotok kimutatásában.

trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). Globális tesztek Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). prokoaguláns aktivitású mikropartikulák

Trombin Generációs Teszt A hemosztázis kitüntetett faktora a trombin, keletkezésének és gátlásának szabályozása kulcskérdés. Az endogén trombin potenciál (ETP) a pro- és anti-koagulációs folyamatokat tükrözi, így alkalmas a hipo- és hiperkoagulabilitás kimutatására. Helye van: diagnosztikában, terápia követésében, hemosztázis gén-gén kapcsolatokban új variánsok, trombózis rizikó vagy védőfaktorok felismerésében.

Trombin Generáció (TG) A trombin a véralvadási rendszer kulcs enzime A trombin az alvadási folyamat enzimatikus szabályozásában kettős szerepet tölt be Alvadási faktorok aktiválása → prokoaguláció Protein C út beindítása → antikoaguláció TG: a trombin aktivitás változásának meghatározása az idő függvényében A klasszikus („clot-based”) alvadási tesztek csak <5% trombin képződéséig mérnek Idő Trombin aktivitás ETP Lag time Maximális aktivitás elérésének ideje Maximális aktivitás ETP: endogén trombin potenciál Prokoagulációs szakasz Antikoagulációs szakasz Kern Anita - 2012/13 I. félév

Trombin Generációs Teszt A trombin generáció görbe jellemzői: lag fázis (t_lag): a plazma alvadási idejével egyezik, trombin csúcs (C_max), csúcsig eltelt idő (t-max): az alvadási folyamat kiterjesztését jelenti, görbe alatti terület (AUC), az endogén trombin potenciál: a trombin aktivitás ideje alatt képződött teljes trombin mennyiségét fejezi ki. A TGT több variációja ismert, amelyek a reakcióban résztvevő komponensektől függően eltérő érzékenységet mutatnak az alvadási faktorok, inhibitorok, thrombocyták működésére. Fibrinolízisre szenzitív reakcióelegy kialakítása még várat magára.

Trombin generációs teszt - tulajdonságok Előnyök Globális teszt: valamennyi pro- és antikoaguláns folyamat megnyilvánul benne A mérési körülmények változtatásával adott funkció specializált meghatározására alkalmazható Platelet-rich plasma (PRP)/Platelet-poor plasma (PPP) Indukálás: TF koncentráció, foszfolipid koncentráció és összetétel Protein C út vizsgálata (APC, szolubilis TM hozzáadása) Lineáris összefüggés a klinikai képpel Hátrány Nehéz megtalálni a megfelelő mérési körülményeket Az egyes laborokban mért eredmények nehezen összevethetők Kern Anita - 2012/13 I. félév E Castoldi, J Rosing Thrombosis Research (2011) 127, S21-S25

Trombin Generációs Teszt A TG első metodikáját 1953-ban közölték le. A módszer manuális és időigényes volta miatt nem terjedt el. Számítógép vezérelte, kromogén szubsztrátos változata nagy előrelépést jelentett a nyolcvanas években. Fluorogén szubsztrát bevezetésével a trombin generáció fibrinogén/fibrin tartalmú plazmában és thrombocyta dús plazmában is mérhetővé vált. A módszer pontosságát fokozta az automaták alkalmazása, de a standardizálás, az eredmények normalizálása napjainkban is zajlik.

Trombin generációs tesztek - történet 1950-es évek: első TG-s mérések Alvadó vér, vagy plazma mintából vett alikvotok fibrinogénen mért alvadási idejéből a trombin aktivitás meghatározása Félautomata módszerek kromogén szubsztráttal Alikvotok koncentrációmeghatározása kromogén szubsztráttal Defibrinált plazmát igényel (fényszórás zavarja az optikai mérést) α2-makroglobulin:trombin komplexet aktív trombinnak méri Automata módszerek kromogén szubsztráttal A kromogén szubsztrát hozzáadása az alvadó plazmához Automata módszerek fluorogén szubsztráttal Nem igényel defibrinálást, akár teljes vér is használható Kern Anita - 2012/13 I. félév

Mérési eredmények értékelése Fluoreszcens jel → Deriválás → Enzimaktivitás kinetikája Korrigálás α2-makroglobulinnal → Hemker et. al (pszeudo-elsőrendű reakciókinetika feltételezése) → Trombin generációs görbe Görbe paraméterek meghatározása (ETP, lag time, peak trombin, time to peak, v index) Kern Anita - 2012/13 I. félév

Mérési eredmények értékelése Fluoreszcens jel → Deriválás → Enzimaktivitás kinetikája Korrigálás α2-makroglobulinnal → Hemker et. al (pszeudo-elsőrendű reakciókinetika feltételezése) → Trombin generációs görbe Görbe paraméterek meghatározása (ETP, lag time, peak trombin, time to peak, v index) Kern Anita - 2012/13 I. félév

Mérési eredmények értékelése Fluoreszcens jel → Deriválás → Enzimaktivitás kinetikája Korrigálás α2-makroglobulinnal → Hemker et. al (pszeudo-elsőrendű reakciókinetika feltételezése) → Trombin generációs görbe Görbe paraméterek meghatározása (ETP, lag time, peak trombin, time to peak, v index) Kern Anita - 2012/13 I. félév

Trombin Generációs Teszt A trombin-képződés kinetikáját sok tényező befolyásolja, így az alvadási faktorok és inhibitorok mennyisége, milyensége; a szöveti faktor és egyéb stimulánsok; valamint a thrombocyták mennyisége és funkciója. Az automatizált metodika (Calibrated Automated Thrombogram, CAT) trombin szubsztrát kinetikáját méri a felszabaduló kromofór vagy fluoreszcens jel alapján, és szoftver program segítségével számítja ki a trombin aktivitását.

Triger koncentráció hatása Kern Anita - 2012/13 I. félév

Szöveti faktor / Foszfolipid arány hatása Kern Anita - 2012/13 I. félév

TG klinikai alkalmazási lehetőségei Antikoaguláns terápia követése: A különböző támadáspontú antikoagulálás közös pontja a trombin generáció csökkentése. A K-vitamin antagonisták a protrombin-trombin átalakulást fékezik. A frakcionálatlan heparin az antitrombin-trombin gátlást fokozza több nagyságrenddel. A direkt trombin gátlók az aktív centrumot gátolják, a direkt anti-Xa-szerek pedig a tenáz komlexben levő faktort blokkolják. A TG globális teszttel ezek a különböző támadáspontú hatások egy rendszerben követhetők. Hiperkoagulabilitás meghatározása: Ha a TG a szöveti faktort (TF) alacsony vagy magas koncentrációban tartalmazza, és trombomodulinnal (TM) vagy aktivált protein C-vel (APC) egészíti ki, a rendszer alkalmassá válik fokozott alvadási készség kimutatására. Fokozott vérzékenység kimutatása: A teszt érzékeny a csökkent alvadási kapacitás kimutatására, így alkalmas lehet szerzett hígulásos alvadászavar (műtéti hemodilúció) vagy öröklött vérzékenység faktorpótlásának meghatározásában.

trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). Globális tesztek Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). prokoaguláns aktivitású mikropartikulák

Trombelasztográfia (TEG) A Hartert (1948) által feltalált műszerrel a teljes vér viszko-elasztikus tulajdonságai, az alvadék képződésének, stabilitásának és oldékonyságának dinamikája követhetővé váltak. A vérben alacsony, a vénás áramlást imitáló nyírófeszültség mellett zajlik az alvadás az indukciótól a fibrinolízis bekövetkeztéig. Az akár órákig is eltartó folyamat mérése ilyen formában nem tudott a diagnosztika fegyvertárába bekerülni.

Trombelasztográfia (TEG) A technikai változtatások ma már a point-of-care diagnosztika részévé tették. A TEG fejlesztett változata a rotációs trombelasztometria (ROTEM). Teljes vér (natív vagy citrátos) vagy plazma kerül az egyszer használatos küvettába, amelybe egy függőleges tengely körül rotációs mozgást végző henger merül. Az alvadék képződése a rotációs mozgást lefékezi. A mozgás változását a műszer matematikai transzformációval alvadék erősséggé számolja (amplitúdó/mm), és az idő (sec) függvényében ábrázolja. A szoftver grafikusan és számérték szerint is elemzi a trombelasztogramot.

Haemoscope TEG® Figure 8 37

ROTEM® instrument Figure 9 38

TEG ROTEM

TEG R Indítástól az alapvonaltól 2 mm eltérésig eltelt idő (alvadási idő, CT; alvadási faktorok és inhibitorok egyensúlya) K Alapvonaltól (2 mm) 20 mm-ig eltelt idő (alvadék képződési idő, CFT) Α TEG kezdeti meredeksége (2 mm-nél levő meredekség; az alvadék keletkezésének sebessége) MA Maximális amplitúdó (MCF, az alvadék erőssége, stabilsága: thrombocyta-fibrinogén interakció, fibrin polimerizáció) G Az alvadék rugalmassága (MCE) CL30 Az alvadék lízise adott időben. TTL A fibrinolízis elindulásához szükséges idő (MA-tól 2 mm; fibrinolízis aktivitás, FXIII). A natív mintát 3 percen belül kell mérni, a citrátos minta négy óráig stabil. Aktivátor nélküli mérés 30-60 percig, míg aktivátorral kb.10 percen keresztül tart. A ROTEM nemcsak globális képet ad a beteg hemosztatikus állapotáról, hanem differenciál diagnosztikai eszközként is használható a tesztek módosításával.

ROTEM Az EXTEM alap teszt, amelyben rekombináns TF indítja az alvadást. A maximális alvadék erősség (MCFEXTEM) főként a thrombocyták működésétől és a fibrinogén szinttől függ, és ha a küvetta thrombocyta gátlót (cytochalasin D) tartalmaz, szerepük szétválasztható. MCFFIBTEM méri a fibrinogén hatását az alvadék erősségében. Az MCF kritikus értéke 15 perc, e fölött fibrinogén koncentrátum adása jön szóba. Normál MCFFIBTEM (>12 mm) és alacsony MCFEXTEM (< 5 mm) thrombocyta pótlást indikál. CTEXTEM jelzi a csökkent alvadékonyságot is, a faktorpótlás (FFP, PCC) küszöbértéke 100 sec. Az EXTEM alapteszt és fibrinolízis gátló (aprotinin) tartalmú teszt (APTEM) együttes meghatározásával kisfokú hiperfibrinolízis is kideríthető, ha a két méréssel kapott értékek hányadosa <0,8 (CTAPTEM/ CT EXTEM ).

ROTEM Az INTEM (APTI-hez hasonló kontakt aktiváció) általános alvadási státusz megítélésére, HEPTEM heparináz tartalommal heparin hatás, ecarinnal pedig speciális antikoaguláns mérésre (hirudin) alkalmas. A ROTEM masszív vérzéseknél segítséget jelenthet a döntések meghozatalában, terápia indításában. Sebészeti vérzésnél elsőként az EXTEM és a FIBTEM szimultán végzése ajánlott. Az INTEM és a HEPTEM meghatározás elsőként heparinizált betegnél indokolt, második lépésként pedig bármely sebészeti betegnél, ahol a heparinizáció a vérzéshez hozzájárulhat. A TEG alkalmassá tehető a thrombocyta blokkolókra (aszpirin, clopidogrel) non-responder vagy hiper-responder egyedek kiszűrésére. A trombin a legerősebb trombocyta agonista, és ha gátoljuk, a többi agonista hatása megítélhetővé válik. A mérőrendszerben a heparin gátolja a trombint, a hozzáadott reptiláz és F XIIIa fibrinhálót képes kialakítani a thrombocytákkal együttműködve. Arachidonsav vagy ADP hozzáadásával az MA közel normális lesz, kivéve azoknál, akik aszpirinre, vagy clopidogrelre megfelelően reagálnak.

Globális tesztek Globális tesztek: trombin generációs teszt (TG), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelasztometria (ROTEM). prokoaguláns aktivitású mikropartikulák

Mikropartikulák A plazmában jelenlévő mikropartikulák (MP) észlelése évtizedekkel korábbra tehető. Megfigyelték, hogy nagy sebességű centrifugálás után a plazma alvadási ideje megnyúlik, tehát a centrifugálással prokoaguláns részecskék távolítódnak el a plazmából. Az utóbbi években ráirányult a figyelem a sejtekből leváló mikropartikulák hemosztázisban játszott szerepére. Forrásuk: a keringésben levő elemek közül a thrombocyták (70-90%), illetve a vörösvértestek, fehérvérsejtek, a helyhez kötöttekből pedig az endothel. A thrombocytákból származó MP (PMP) keletkezhet thrombocyta aktiváció során, megakariocytákból a megakaryopoiesis során, vagy a vérlemezkék apoptózisa esetén. Egyéb sejtekből szintén aktiváció, interakció vagy apoptózis eredményez MP képződést. A részecskék lefűződött membrán darabok, foszfolipid tartalmú vezikulák, a forrásuknak megfelelő sejt-markereket hordoznak. Méretük 0,1 - 1 μm. Főbb összetevőjük: fehérje, foszfolipid, de mRNS-t és priont is hordozhatnak.

MP képződése

MP Egyensúlyi állapotban a membrán-foszfolipidek aszimmetrikus elrendeződést mutatnak, ez három enzim működéséhez kötődik: flipáz, flopáz és szkrambláz. A flipáz a foszfatidil-szerint (PS) és foszfetidil-etanolamint (PE) kívülről beforgatja, a flopáz foszfolipideket mozgat kifelé. A szkrambláz foszfolipid transzportot végez a membrán két monolayere között, egyensúlyi állapotban inaktív. MP feltételezett képződési mechanizmusa a sejt aktiválódásakor vagy apoptóziskor: a felszabaduló Ca++ enzimeket aktivál, melyek membrán átrendeződést okoznak. Emellett aktiválja a kalpain enzimet, amely a fehérjék és a citoszkeleton közötti kapcsolat megszűnéséhez, ezáltal a membránból MP lefűződéshez vezet. A MP foszfolipid tartalmának nagy százalékát általában PS és PE adja, kivéve, ha endothel sejtből apoptózissal keletkeznek, ekkor az annexin V tartalom magas. A MP fehérje tartalma is változhat, pl. a PMP trombin vagy kollagén aktiváció után GP IIb/IIIa komplexet tartalmaz, míg komplement aktiváció után nem.

MP MP meghatározása: Mérőeszközökből csak módosított impedancia FlowCytometer használható. Másik lehetőség szolid-fázishoz kötődésen alapszik (annexin/antitest), ahol a mennyiség mellett a prokoaguláns aktivitás mérhető, de ez nem alkalmazható minden esetben. A PMP prokoaguláns aktivitása 50-100-szorosa az ugyanakkora aktivált thrombocyta felszínnek. Ennek magyarázata a TF jelenléte. A sérülés helyén az aktivált endothel sejtből és thrombocytából protein diszulfid izomeráz szabadul fel, amely konformáció változást okoz a TF-ban, így felgyorsul a komplexképződés a TF-FVIIa-FXa között. A TF-MP monocytákból is származhat (MMP), amely P-szelektin ligandot (PSL-1) is hordoz.

MP A keringő MP mennyisége emelkedhet különböző patológiás állapotokban: Trombózis (VTE, HIT-II, TTP, PNH, sarlósejtes betegség) Kardiovaszkuláris betegség (hipertenzió, hiperlipidémia, atherosclerosis, akut koronária szindróma) Infekció (szepszis, HIV, prion betegség).   A MP patológiai szerepe miatt szükséges a keletkezésük, aktivitásuk behatóbb ismerete, és a metodikák standardizálása.