AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE 10. SZEMINÁRIUM AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE

SEJTSZEPARÁLÁS Számunkra érdekes sejteket fizikailag elkülönítjük egy heterogén populáció többi tagjától A sejtek fizikai, biológiai vagy immunológiai különbözőségeit használjuk ki. (A sejtfelszíni markerek kifejeződésének mértékében is gyakori a különbség – lehetőség van a szeparált élő sejtek további vizsgálatára). fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének A szeparálás eredményességét jelzi: tisztaság, visszanyerés hatékonysága, sejtek életképessége

KÉTFÉLE SZEPARÁLÁSI STRATÉGIA Pozitív szeparálás Negatív szeparálás elkülöníteni kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől pl. a sejtek valamelyik sejtfelszíni molekuláját (CD markerét) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük A sejteket a szeparálási folyamat körülményei mellett a receptorához kötött ellenanyag direkt módon befolyásolhatja. A pozitív szeparáció viszont gyakran nagyobb tisztaságot eredményez. a nem kívánatos sejtek megjelölése és megszabadulás tőlük A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok esetén inkább ezt használják.

FICOLL-PAQUE SŰRŰSÉG ALAPÚ SEJTSZEPARÁCIÓ Perifériás vér (vagy buffy coat) Mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása egy másik csőbe, hogy megszabaduljunk a Ficoll-tól Sejtek pipettázása a Ficollra Szeparált sejtek centrifugálás plazma ficoll Vörösvértestek Mononukleáris sejtek (PBMC) Neutrofil granulociták Egy egység teljes vérből centrifugálással előállított vérkomponens, amely a fehérvérsejtek és a thrombocyták jelentős részét tartalmazza.

(from Google pictures) (Nature Protocols http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.2008.69-F1.jpg)

A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK Mágneses sejtszeparálás (MACS) Antigén specifikus ellenanyag MACS = Magnetic-activated cell sorting Paramágneses szemcse

Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció) MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció)

A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK Fluoreszcens sejtszeparálás (FACS) NKT sejtek Például: NKT sejt szeparálás (CD3/CD56) NK sejtek Vér minta limfociták T sejtek

cseppleszakadási pont Az áramlási cella vibrációjának hatására a folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik cseppleszakadási pont

- - - - - - - - - + + + + Lézer vibráció + Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra elektromos töltés kapcsolódik (arra a rövid időre), így a leváló csepp töltötté válik. - + - + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + + + - + + + - - - - - - gyűjtőcső gyűjtőcső szemét

AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA FAGOCITÁLÓ SEJTEK – FAGOCITÓZIS VIZSGÁLAT Különböző fluorofórokkal jelöltek elölt patogének alkalmazása (baktériumok: E. coli, S. aureus; élesztő: S. cerevisiae) A fagocitózis detektálható fluoreszcens mikroszkóppal vagy áramlási citometriával

LIMFOCITA AKTIVITÁS MÉRÉSE T- és/vagy B-sejtek funkcióját érintő immundeficienciák kimutatására A limfociták specifikus antigénnel történő aktivációja alig detektálható (az antigénspecifikus sejtek száma alacsony) Poliklonális limfocitaaktivációt kiváltó anyagok segítenek az abnormális limfocita funkciók vizsgálatában

HUMÁN T ÉS B SEJTEK POLIKLONÁLIS AKTIVÁCIÓJA Lektinek (pl. Concanavalin A és PHA) receptorok keresztkötésén keresztül hatnak Intracelluláris jelátviteli kaszkád aktivátorok (PMA – PKC aktivátor, Ionomycin – emelkedett intracelluláris Ca2+ szint) Specifikus antitestek (anti-IgM, anti-CD3, anti-TCR)

POLIKLONÁLIS T SEJT AKTIVÁTOROK POLIKLONÁLIS B SEJT AKTIVÁTOROK Phytolacca americana Pokeweed (álkörmös) mitogen (PWM) Staphylococcus protein A szuperantigén (SpA) Epstein Barr Vírus (EBV) (transzformáló hatás) Anti-IgM antitest Canavalia ensiformis POLIKLONÁLIS T SEJT AKTIVÁTOROK Pokeweed = álkörmös (Phytolacca americana) – korábban a vörösbor színezésére használták (toxikus) Phytohaemagglutinin (PHA) kardbabból (Canavalia ensiformis) Concanavalin A (ConA) veteménybabból (Phaseolus vulgaris) Phytohaemagglutinin (PHA) Concanavalin A (ConA) Anti-CD3, Anti-TCR antitestek Phaseolus vulgaris

Receptorok ligand általi keresztkötése (pillanatszerű) Foszforilációs lépések (másodpercek-percek) Western blot Antigén receptorok (TCR, BCR), citokin receptorok, stb. i.c. Ca2+ emelkedés Áramlási citometria Fluoreszcens mikroszkópia Génaktiváció qRT-PCR  mRNS Western blot  fehérje Citokin szintézis i.c. citometria Citokin szekréció ELISA ELISPOT Limfocita aktiváció A vizsgálat gyakran specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul Életképesség/apoptózis halott sejtekre specifikus festékek Sejtosztódás 3H-thymidine CFSE MTT

A CA2+ SZIGNÁL MÉRÉSE ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL Fluoreszcencia arányos az intracelluláris Ca2+ koncentrációval idő Fluo-3 vagy Indo-1 A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció mérése fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható /Fluo-3 vagy Indo-1/ mikroszkópos detektálás  lásd 6. szeminárium 7. dia sejtaktiváció alapjel

INTRACELLULÁRIS CITOKINTERMELÉS KIMUTATÁSA IMMUNFLUORIMETRIÁVAL jelölt citokin-specifikus ellenanyagok a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá lehet tenni de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker”, pl. CD4) cytokines

GÉNAKTIVÁCIÓ VIZSGÁLATA A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható Pl. citokin gének aktivációja KVANTITATÍV (REAL-TIME) PCR (qPCR/qRT-PCR) sejtek  RNS izolálás RNS  reverz transzkripció (RT-PCR)  cDNS cDNS  polimeráz láncreakció (PCR) mennyiségi meghatározás (a génaktiváció fehérje szinten történő vizsgálata WB) A többi RNS mennyiség meghatározásához használt módszerrel (pl. northern blot) összehasonlítva a qPCR a leghatékonyabb, legérzékenyebb és legpontosabb módszer. Az mRNS mennyiséget háztartási gének mennyiségéhez viszonyítva kell meghatározni. (A Western blot esetében legtöbbször a ß-aktint használjuk viszonyítási alapként.) minél több mRNS-t tartalmazott a minta, annál hamarabb (kevesebb ciklus alatt) éri el az amplifikáció a küszöböt

ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot elve hasonló az ELISA-hoz Ig-okat, citokineket, kemokineket, granzimet és más oldott effektor molekulákat termelő sejtek számának meghatározása érzékeny módszer: 1 aktivált sejt kimutatása 300 000 közül. (Nemcsak poliklonális, de antigén specifikus aktivációt követően is kimutatja az aktivált sejteket.)

ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot - Antigén specifikus „capture” ellenanyagok kitapasztása - Blokkolás Citokintermelő sejt helyét jelölő folt - Sejtek hozzáadása (aktiváció, inkubáció) - Mosás - Biotinnal konjugált antigén specifikus másodlagos ellenanyag hozzáadása - Avidin-enzim konjugátum - Oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-ethylcarbazol) Az ELISPOT lemez egy lyukának felülnézete a képződött foltokkal

ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot Leolvasás mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy „ELISPOT plate reader” segítségével (gyors, standardizálható - spotok számának és méretének meghatározása)

ÉLETKÉPESSÉG VIZSGÁLAT MTT (Dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium só) Életképesség kolorimetriás mérése (apoptótikus sejtek). NADPH-függő celluláris oxireduktáz enzimek az MTT festéket oldhatatlan lila színű formazánná redukálják. PI (propidium-jodid) Egy fluoreszcens molekula, amely képes a nukleinsavba beépülni. Áramlási citometriával vizsgálható az életképesség. Élő sejtekbe nem képes behatolni. 7-AAD (7-aminoactinomycin D) Egy fluoreszcens molekula, amely duplaszálú DNS-be interkalálódik. Élő sejtek membránján nem képes átjutni, vagyis használható életképesség mérésre áramlási citometriával.

SEJTOSZTÓDÁS VIZSGÁLATOK 3H-jelölt timidin beépülés- a növekvő DNS tartalmat méri (β-bomlás mérése). Nem detektálja, hogy hány sejt hányszor osztódott. Bromodeoxyuridin (BrdU) - timidin-analóg, adható kísérleti állatokba vagy sejtkultúrákhoz. Az osztódó sejtek BrdU specifikus ellenanyagok felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). CFSE (Karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter) Fluoreszcens festék, amely könnyen bejut a sejtekbe és intracelluláris amin struktúrákhoz kötődik. Tanulmányozható a sejtosztódás, migráció, elhelyezkedés.

CFSE SEJTOSZTÓDÁS NYOMON KÖVETÉSE „Cell tracer” festékek bekerülnek a sejtekbe és csapdába esnek Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez In vitro és in vivo nyomon követhető a limfociták osztódása Fokozatosan a felére csökken a fluoreszcencia intenzitás az utódsejtekben CFSE-vel jelölt nem osztódó, nem aktivált sejtek fluoreszcens intenzitása