BIOTECHNOLÓGIA D MsC gyakorlat Tervezési feladat
oriV: szűk gazdaspecificitás Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia oriT oriV Ar1 vad típus mutáns poláris hatás ?
A FELADAT ÁLTALÁNOS MEGFOGALMAZÁSA A LEOLVASÁSI KERET MEGSÉRTÉSE NÉLKÜL KI KELL ÜTNI EGY GÉNT EGY BAKTÉRIUMBAN ÉS HELYETTE UGYANEBBEN A BAKTÉRIUMBAN KELL TERMELTETNI A KIÜTÖTT GÉN TERMÉKÉT FÚZIÓS FEHÉRJE FORMÁJÁBAN
MEGOLDÁSI SÉMA 1. A megadott célgént tartalmazó genomi lókusz letöltése, a célgén és a környező gének pozíciójának kijelölése Eszköz: internet, adatbankok pl. NCBI, Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery
Ekkor a gén 3 043 bp-nál kezdődik és 1 485 bp-nál ér véget complement(1934864..1936042) Csak a 1 933 000 – 1 938 000 régió kell Ekkor a gén 3 043 bp-nál kezdődik és 1 485 bp-nál ér véget Complement!
oriV: szűk gazdaspecificitás Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia oriT oriV Ar1 vad típus mutáns poláris hatás ?
DE! A két szakasznak nagyjából egyforma hosszúnak kell lennie, Hogy azonos legyen a rekombinációs valószínűség 500-1000 bp 500-1000 bp
A VEKTOR KIVÁLASZTÁSA Szempontok: Az adott feladathoz szabad-e, kell-e replikálódnia a vektornak a célsejtben Olyan antibiotikum rezisztenciát hordozzon, mely antibiotikumra a sejt érzékeny Milyen módon lehet bejuttatni a célsejtbe DNS-t
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI SZF TSZE Fúziós partner GS Pr -35 -10 SD kódoló szekvencia TT -35 -10 STOP kodon UAAU UGA UAG TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt