Barabás Eszter SE-LMI, Központi Laboratórium (Pest) 2013.05.30 Hematológiai és hemosztazeológiai vizsgálatok preanalitikai vonatkozásai Barabás Eszter SE-LMI, Központi Laboratórium (Pest) 2013.05.30

A laboratóriumi tevékenység három szakaszra bontható: Preanalitikai szakasz - laboratóriumon kívüli - laboratóriumon belüli Analitikai szakasz Posztanalitikai szakasz ,

Preanalitikai folyamatok Laboratóriumon kívül vizsgálat kiválasztása, kérése beteg előkészítése, azonosítása mintavétel mintaszállítás Laboratóriumon belül minta átvétele és azonosítása minta előkészítése minta minőségének ellenőrzése minta tárolása

Beteg azonosítása Legalább két azonosító Beteg jelenlétében címkézzék fel a csövet Egyszerre csak egy beteggel foglalkozzanak Betegtévesztés okai és gyakorisága

In vivo eltéréseket okozó tényezők nem kor testsúly cirkadián bioritmus étkezés gyógyszerek betegségek, műtétek etnikai és földrajzi tényezők terhesség stressz

Biológiai variabilitás Egy faj egyedei egymástól bizonyos tulajdonságokban, genetikai és környezeti okokból kifolyólag különböznek - egyedek közti variabilitás Inter-individual - egyedi variabilitás Intra- individual

Egyedek közötti (interindividuális) variabilitás Egyes laborparaméterek különböző egyének közti eltérő koncentrációja. életkor nem rassz terhesség testsúly

Egyeden belüli (intraindividuális) variabilitás Egy egyénben, egy adott paraméter koncentrációjának az ingadozása a kiindulási ponthoz képest. Napszaki ingadozás Havi Szezonális Életkorral összefüggő (PC) Diéta, betegség, gyógyszeres kezelés, stressz hatás Véralvadási fakt. Kora éjjeli órákban min. PAI min.koradélután, max.hajnali 2-6 Stressz: hiperkoaguabilitás, hiperfibrinolízis

A beteg előkészítése 12 órás táplálékmegvonás (bizonyos vizsgálatokhoz étrendi előírások betartása pl. glükóz terhelés, zsíranyagcsere vizsgálat) DE bő folyadékfogyasztás (víz, cukor nélküli tea! ) élvezeti szerek kerülése (dohányzás!) gyógyszerek fizikai aktivitás ,

Étkezés, stimulánsok A véralvadás folyamatait a szélsőségektől mentes, kiegyensúlyozott étrend nem befolyásolja. Így a vérvételnek nem szükséges éhgyomorra történnie, könnyű (alacsony zsírtartalmú) reggeli elfogyasztható előtte. Haldiéta (makréla) csökkenti a vérlemezke számot és alacsonyabb fibrinogén-szintet mérhetünk a következő pár hétben. A trombociták aggregációja csökken a halolajban levő többszörösen telítetlen zsírsavak miatt. Nagy mennyiségű C, E-vitamin, gyömbér, hagyma fogyasztása zavarja a trombocita aggregációt. Krónikus alkoholizmus csökkent trombocita számhoz és aggregációhoz vezet. Dohányzás: fokozza a trombocita aggregációt és adhéziót, növeli a fibrinogén szintjét.

Gyógyszerek Befolyásolhatják a véralvadást terápiásan, illetve mellékhatásokon keresztül. Utóbbira néhány példa: NSAID: az acetilszalicilsav irreverzibilisen gátolja a COX enzimet, ezzel csökkenti/megszünteti a trombocita aggregációt. Orális fogamzásgátlók: hatásukra a legtöbb alvadási faktor aktivitása nő, fokozódik a trombocita aggregáció, míg az AT és PS szintje csökken. Széles spektrumú antibiotikumok K-vitamin-hiányt okozhatnak a bélflóra károsítása által.

Egy könnyű étkezés hatása a vérsejt paraméterekre Étkezés után neutrofil és MCH szignifikánsan nő, limf.,eo, monocita, RDW, MCV,hematokrit szign. csökken Giuseppe Lippi Influence of a light meal on routine haematological tests. Blood Transfus. 2010

Mintavétel - Testhelyzet Függőleges pozícióban hemokoncentráció ( a vérsejtek és a fehérjék koncentrálódnak, mert a folyadék átjut az erekből a környező szövetekben) Fekvő pozícióban hemodílúció Egészséges egyénekben a mért értékek akár 10-20%-kal alacsonyabbak fekvő helyzetben, mint függőlegesben, ödémásokban ez az arány még nagyobb lehet. Annak érdekében, hogy összehasonlítható eredményeket kapjunk, a vérmintákat adott betegtől mindig ugyanabban a testhelyzetben vegyük le.

Érték emelkedése, ha a fekvő beteg feláll < 10 % hemoglobin, fehérvérsejtszám, kalcium, GOT, GPT, albumin, összfehérje, triglicerid, koleszterin 10-20 % hematokrit, vörösvérsejtszám, apolipoproteinek > 50 % adrenalin, renin

Mintavétel – Vérvételi technika Vérvétel helye: valamelyik perifériás véna, többnyire a vena cubitalis.

Mintavétel – Vérvételi technika Kompresszió ne tartson tovább 1 percnél, és csak az éppen szükséges erejű legyen. Tűméret A túl sokáig/túl nagy erővel történő véna okklúzió a fibrinolízis lokális aktivációjához, megnövekedett faktor koncentrációkhoz/ -aktivitáshoz vezet. ,

Mintavétel – Vérvételi technika A vér zavartalanul, örvénylést okozó megtörés nélkül és rövid idő alatt jusson a csőbe. - Túl gyors áramlás esetén a trombociták/vörösvértestek károsodhatnak, hemolízis jöhet létre - Túl lassú áramlás esetén pedig a vérminta alvadása beindul, akár látható formában alvadékképződéssel, akár láthatatlanul, az alvadási faktorok aktivációjával. Vérvétel ne kanülből történjen ! Ilyen esetben a mintavétel a másik kar vénájából történjen, vagy a kanül fiziológiás sóval történő átmosását és az első 10-15 ml vér leengedését követően.

Mintavétel – Vérvételi eszközök

Correct order is: E, D, A, B, C, F (53% correct answers) This order is based on CLSI guideline H3-A6 (2007). The important items are: 1. Prevent bacterial contamination from unsterilized tubes (blood culture tubes first) 2. Cloth activator in gele tubes can affect to TT and APTT (citrate tube before gele tubes) 3. Prevent anticoagulant contamination (heparin-EDTA-fluoride) http://medlab-eqas.blogspot.hu/2011/01

Mintavétel – Vérvételi eszközök Vérvétel helyes sorrendje: Hemokultúra Citrátos minta Natív cső Heparinos minta EDTA-s minta Egyéb Abban az esetben, ha csak alvadási tesztek végzésére van szükség, a citrátos minta előtt EDTA-s vér vétele történjen, ugyanis a szúrás után nyert első mintában levő szöveti tromboplasztin téves eredményeket okozhat. Bármely (indokolatlanul) kóros eredmény esetén, új mintavétel javasolt és a vizsgálatot meg kell ismételni.

Mintavétel Hematológiai kórképek diagnosztikájára K2-EDTA alvadás gátlót tartalmazó lila dugós csőbe, szakszerűen levett vénás vérminta szükséges. A hemosztázis diagnosztikájában általában plazmát használunk. Ez alól kivételt képez: - antifoszfolipid antitestek vizsgálata (szérum) - heparin indukálta thrombocytopenia szűrőtesztje (szérum) - genetikai vizsgálatok, PFA-100 (teljes vér)

Mintavétel Figyelni kell a helyes citrát:vér arányra (1:9). Ha a vérmennyiség kevesebb a kelleténél, a plazma magas citrátkoncentrációja megnyúlt alvadási időket (főként APTI) okoz, a nagymértékű kalciummegkötés miatt. A jelenleg használatos vákuumos csövekben a vákuum biztosítja a megfelelő citrát:vér arány elérését. A fenti aránytól kb. 10%-os eltérés még elfogadható. Az alvadásgátlót tartalmazó csöveket, a levételt követően, azonnal többször, finoman össze kell forgatni ( átbillenteni 180 ⁰ , legalább 4x), de sohasem rázni.

Mintaszállítás Álló helyzetű, lezárt csövekben történjen Kerülendő a minták rázatása (hemolízis, alvadás aktiváció) Centrifugálatlan minták szállítása 15-20 ⁰C-on történjen Sínekkel ellátott szállítóegység Pneumatikus cső

A minták laboratóriumon belüli kezelése - minta átvétele és azonosítása - minta előkészítése - minta minőségének ellenőrzése - minta tárolása ,

Minta előkészítése, kezelése Minden emberi vérmintát potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni és úgy is kell kezelni!

Minta előkészítése, kezelése Meg kell várni a teljes alvadást natív cső esetén (30 perc) Centrifugálás időtartama natív cső esetén 10 perc, 1800g Plazma szeparálás esetén 2-3000 g, 10-15 perc Túl hamar történő centrifugálás: fibrinszál kiválás, hemolizált minta

Minta előkészítése – hemosztázis vizsgálatokhoz A véralvadás vizsgálatára használt mintavételi csövek antikoagulánsként 3,2%-os Na-citrát oldatot tartalmaznak. A citrátos vérmintából centrifugálás által jutunk citrátos plazmához. Trombocitadús plazma (PRP) (Plt>10 G/l): 37 oC-on 800 rpm, 5 perc centrifugálással nyerjük, trombocitafunkciós mérésekhez használjuk. Trombocitaszegény plazma (PPP) (Plt<10 G/l): szobahőmérsékleten 3000 rpm, 10-15 perc centrifugálással kapjuk, a rutin hemosztázis-vizsgálatokhoz ezt használjuk. Trombocitamentes plazma (PFP): 4000 rpm, 20-30 perc centrifugálással nyerjük, és a PPP-hez hasonlóan használhatjuk. Különösen alkalmas olyan tesztekhez, ahol a vérlemezkék zavarhatják a meghatározást (trombocita faktorok, heparin monitorozás, LA, egyéb antifoszfolipid antitestek, fibrinolízis elemei). Felhasználásig fagyasztva tárolandó.

Minta minőségének ellenőrzése Minden mintát érkezés/centrifugálás után vizuálisan ellenőrizni kell. Vizsgálatnak nem megfelelő vérvételi csőbe történt a mintavétel. Alvadékos minta (mikroalvadék! ) Nem megfelelő citrát:vér arány

A hematokrit hatása a citrát relatív mennyiségére Kamal A H et al. Mayo Clin Proc. 2007;82:864-873

Hematokrit és a véralvadási vizsgálatok Alacsony, illetve magas hematokrit esetén téves alvadási eredményeket kapunk. ha htk>0,55 (55%): fiziológiás újszülöttekben, illetve előfordul olyan betegségekben, ahol a vörösvértest-szám nő (policitémia vera, szívbetegségek), és így a plazma aránya csökken → relatív citrát-túlsúly. Ilyenkor nyitott, hagyományos vérvétel esetén a szokásos citrát:vér arányt módosíthatjuk. A vénás vér megfelelő mennyisége kiszámítható a következő képlet alapján: vér (ml) = 9 x Na-citrát oldat (ml) x 0,55 / (1,00 – hematokrit) ha htk< 0,25 (25%): a fenti formula alapján módosítandó a helyes arány. Kenet és hematokrit !

Minta minőségi eltérései Hemolízis Hyperlipidaemia Hyperbilirubinaemia

Mintatárolás- Hemosztázis PI esetén 24, egyéb vizsgálatok esetén pedig 4 órán belül végre kell hajtani a méréseket. Ha a minták csak a későbbiekben kerülnek felhasználásra, a plazmákat le kell fagyasztani. Trombocitafunkciós vizsgálatok esetén a mintavételt követően azonnal meg kell kezdeni a mérést és két órán belül be kell fejezni.

Mintatárolás -Szobahőmérsékleten a PI stabilabb, mint az APTI, de a hőfok emelkedésével mindkettő értéke kifejezetten nő (sec). -A leglabilisabb faktor a FVIII -Magas hőmérséklet (beleértve direkt napfény) mindenkor kerülendő -Hűtőszekrényben (2-8 oC) való tárolás nem ajánlatos, mivel ez a FVII, valamint FXI, XII hidegaktivációjához, ezáltal a megfelelő szűrőtesztek rövidült alvadási idejéhez vezet ,

Mintatárolás Az újrafagyasztás és –felengedés kerülendő. Ha a minta csak a későbbiekben kerül felhasználásra, a trombocitamentes plazmát (PFP) a vérvétel után 1 órán belül leválasztjuk a sejtes elemekről és zárt csövekben fagyasztva tároljuk. Rövid ideig tartó (<2 hét) tárolásra elegendő a – 20 oC, de hosszabb idő esetén (<6 hónap) legalább -70 oC a megfelelő tárolási hőmérséklet. A fagyasztott mintákat 37 oC-os vízfürdőben engedjük fel, majd alaposan összekeverjük. Ezután azonnal megkezdjük a mérést, mivel számtalan faktor stabilitása csökken felolvasztás után. Az újrafagyasztás és –felengedés kerülendő.

Mintatárolás-Hematológia A vérképes mintát 8 órán belül mérni kell, ha szobahőmérsékleten tároljuk 24 órán belül mérni kell, ha +4Co-on tároljuk Kenet készítés azonban 4-5 órán belül történjen!

Nem megfelelő mintatárolás hatásai Szobahőmérsékleten való tároláskor 8 óra után bekövetkező változások: - vörösvérsejtek elvesztik bikonkáv alakjukat - MCV ↑, Hct↑ - ozmotikus fragilitás↑ - fehérvérsejt szám↓ - abszolút lymphocyta szám↓ - retyculocyta szám már 6 óra után↓ - magvas vörösvérsejtek 24-36 óra után eltűnnek -MPV↑, IRF↓ +4Co –on a stabilitás 24 óráig megmarad, kivétel a reticulocyta, trombocyta paraméterek és a qualitatív vérkép!

Vérvétel után 12 órával készült kenetek esetén: Neutrophil granulocyták Lymphocyták Monocyták Vörösvérsejtek

Mikor utasítható vissza a vizsgálatkérés? Ha a minta: alvadékos nem megfelelő/elégtelen mennyiség nem megfelelő a cső a vizsgálathoz nem megfelelő tárolás/szállítás címke olvashatatlan, elégtelen jelölés, azonosítási bizonytalanság (hemolízis)

Összefoglalás Preanalitikai szakban számos tényező befolyásolja a levett vérminta minőségét. Odafigyeléssel és az előírások betartásával ezen hibák elkerülhetőek és korrekt, pontos eredményeket szolgáltathatunk.

Köszönöm a figyelmet !