Sejtalkotók az endocitotikus útvonalon Endoszóma. Lizoszóma, fagocitózis, autofágia Dr. L. Kiss Anna Anatómiai, Szövet-és Fejlődéstani Intézet , Semmelweis Egyetem 2016 Endocitózis, fagocitózis, pinocitózis, fagoszóma, lizoszómák, lizoszómális betegségek, autofágia, receptor-mediált endocitózis, clathrin burkos vezikulák, caveolák, endoszómák: korai, késői, reciklizáló. transzcitózis

Endocytosis Endocytosis: aktiv transzport anyagfelvétel plazmamembrán invaginációk közreműködésével: endocitotikus vezikulumok a felvett részecskéket membrán választja el a citoszóltól (a plazmamembrán származéka)

multivezikuláris test Endocitózis endoszóma endoszóma multivezikuláris test

Endoszóma Korai (early) endoszóma: marginális citoplazmában. pH: 6.5-5: a ligandok többsége disszociál a receptoráról (ligand-receptor uncoupling). Fontos organellum a szortirozásban - a plazmamembrán felé: reciklizáló (recycling) endoszóma - a Golgi-apparatus és lizoszóma felé: késői (late) endoszóma Multivezikuláris testek: a korai endoszómák membránja a lumen felé bimbózik sok belső vezikula képződik endoszóma membrán komponensei degradálódnak. Késői (late) endoszóma: mélyebben a citoplazmában, pH savas. Lizoszómális enzimek akkumulálódnak bennük (vezikuláris transport a trans-Golgi hálózat felöl.

Endoszóma Endoszóma: Különböző méretű és alakú membránnal határolt sejtalkotó. Bennéke fokozatosan savasodik proton pumpa a membránban. A felvett receptor-ligand komplexek a savas pH hatására disszociálhatnak A további sorsuk szétválhat

Sejtalkotók az endocitotikus útvonalon: endoszóma korai v. szortirozó endoszóma reciklizáló endoszóma multivezikuláris test késői endoszóma lizoszóma

Multivezikuláris testek

Lizoszómák EM: membránnal határolt sejtalkotók, finom szemcsés szerkezet belül. Tartalom: savas hidrolotikus enzimek (több mint 40), pH optimum: pH 5. Funkció: makromolekulák lebontása hidrolízissel.

Lizoszómák Elsődleges (primer) Másodlagos (szekunder): primer lizoszóma+ fagocitotikus vakuolum heterofág vakuolum autofág vakuolum (fagocitált részecskék: elpusztult sejtek maradványa, baktériumok, elöregedett vvt-k, apoptotkus sejtek és testek, idegen részecskék, stb.) autolizoszóma heterolizoszóma

Lizoszómák I. Elsődleges (primary): csak lizoszómális emzimek Lizoszómális enzimek: nukleázok, proteázok, glikozidázok, lipázok, foszfatázok, szulfatázok, (40 különböző enzim). Egy lizoszómában többféle enzim is! Savas pH : H+ pumpa (proton- ATPáz, vakuola tipusú) a lizoszómák membránjában. Lizoszómális membrán (és a citoszól semleges pH-ja) megvédi a sejtet az önemésztéstől. A membrán védelme: erősen glikozilált fehérjék és lipidek jelenléte a membránban (a cukor láncok gátolják a közvetlen kontaktust az enzimek és a membrán között. Transport fehérjék és proton-ATPáz van a membránban. II. Másodlagos lizoszómák

EM enzim hisztokémia: Nem-specifikus eszteráz. Emzim hisztokémia: a lizoszómális enzimek fény-és elektronmikroszkópos kimutatása mitochondrium β-Glükuronidáz (piros) és savas foszfatáz (barna) ivese hámsejtek lizoszómáiban lysosomes  EM enzim hisztokémia: Nem-specifikus eszteráz.

EM immunocitokémia: (cathepsin D) a máj sejtek lizoszómáiban. 

Lizoszómális enzimek transzportja a Golgi-apparatus tól a lizoszómákig rER, Golgi-app. (Man-6-P jelölés a cis-Golgi hálózatban, Man6P-receptorok a trans-Golgi régióban, vezikuáris transzport a lizoszómákba (savas pH – Man-6-P disszociál a receptoráról (a Man6P-receptorról). Az üres receptort tartalmazó vezikulák visszatérnek a trans-Golgi hálózatba (receptor reciklizáció). mannóz foszforiláció 

Lizoszómális betegségek („raktározási betegségek”) I-sejt kór: a M6P-szignál hiányzik a lizoszómális enzimekről (a megfelelő enzim hiányzik) a lizoszómális enzimek export fehérjeként exocitózissal az extracelluláris térbe jutnak. A lizoszómális enzimek hiánya miatt a nem lebontott anyagok nagy fagoszómákban akkumulálódnak („inklúziók”). Mucopolyszaccharidózis: glükózaminoglikánok (GAGs – ECM-ben) nem bomlanak le az enzim hiánya miatt (α-Iduronidáz). A sejtek megtelnek GAG-tartalmú fagolizoszómákkal.

Lizoszómák Elsődleges (primer) Másodlagos (szekunder): primer lizoszóma+ fagocitotikus vakuolum heterofág vakuolum autofág vakuolum (fagocitált részecskék: elpusztult sejtek maradványa, baktériumok, elöregedett vvt-k, apoptotkus sejtek és testek, idegen részecskék, stb.) autolizoszóma heterolizoszóma

A fagocytosis lépései: 1. Adszorpció: a fagocitálandó részecske a sejtfelszínhez kötődik (receptorokhoz a plazmamembránban). Specifikus receptorok: e.g. Fcγ-receptorsok, complement-receptorok. Nem-specifikus receptorok: (scavanger receptorok): szokatlan szerkezetű szénhidrátokat vagy megváltozott phospholipid mintázatot ismernek fel Élő sejteket nem fagocitálnak! (fehérjék a sejtfelszinen gátló receptorokat aktiválnak a fagocita sejtek plazmamembránjában). IgG molekulák Fc vége Fc-receptor bacterium plasma membran  2. Bekebelezés: a fagocita sejt gallér-szerű nyúlványt növeszt (pseudopodium, lamellipodium), amely körülveszi a részecskét, majd záródik. Aktin microfilamentumok polimerizálódnak a sejtnyúlványon belül. A teljesen kötbezárt részecske leválik a membránrólne. Phagosome keletkezik. actin microfilamentumok 3. Intracelluláris emésztés 

Intracelluláris emésztés Lizoszómák: fagoszómákkal fúzionálnak: fagolizoszómák Lizoszómális enzimek: lebontják a makromolekulákat A keletkező monomerek (aminosavak, cukor monomerek, etc.) átjutnak a lizoszóma membránon a citoszólba (activ transzport). phagosome  lysosome Fagolizoszóma (másodlagos lizoszóma) Emésztés: monomerek transzportja a citoszólba

Nagy méretű részecskék endocitózisa (>0,1-0,5 μm) Fagocytosis Nagy méretű részecskék endocitózisa (>0,1-0,5 μm) Példa: macrophagok and neutrophil granulocyták (professionális phagocyták) baktérium citoplazma nyúlvány macrophage plazmamembrane erythrocyte   Macrophag „bekebelez” 2 vörös vértestet. Nyíl: a cytoplazmatikus nyúlvány széle. Scanning EM. Baktériumok phagocitózisa (vér leukocyták (neutrophil granulocyta).

Ha a fagoszóma nem savasodik…. Fagoszóma savasodása elmarad: nincs fúzió a lizoszómákkal Fagoszómát körülveszi az ER Fagoszóma felszakad Szaporodás a fagoszómán belül

Nem-emészthető anyagok: reziduális testek (telo-lizoszómák) exocitózissal kijuthatnak a sejtből. hosszú életű sejtekben (idegsejtek, szívizom) : lipofuscin-granulumok. idegen részecskék pl. szén darabkák a tüdő makrofágjaiban, vagy pigment szemcsék a bőr makrofágjaiban tetoválás után: a lizoszómákban maradnak egészen a sejtek pusztulásáig, majd újabb makrofágok veszik fel őket. elöregedett vörös vértestek (eritrociták): makrofágok fagocitálják a lépben, májban és a csontvelőben; a szabad vas: ferritinhez kötődik a bomlás termék (hemosiderin): a lizoszómákban barna granulumok : sziderosozómák.

Autophagosome, electron micrograph Autolizoszómák: autofágia A felesleges és/vagy sérült sejtalkotók eltávolítása („a sejt magát eszi”). A C-alakú izoláló membrán az ER-ból. 2 parallel membrán,a belső később „eltűnik”. Autofagoszóma lizoszómával olvad össze, tartalma degradálódik. A sejt egészét érintő autofágia: sejthalál: a programozott sejthalál (apoptózis) egyik formája. Sequestration cisterna (arrows), electron micrograph. Autophagosome, electron micrograph Micrographs by Prof. J. Kovács

Autofágia

Az autofágia típusai

II. Pinocitózis 0,1 μm-nél kisebb részecskék, ill. makromolekulák, oldott anyagok felvétele endocitózissal.A keletkező vezikulumok átmérője: 50-100 μm. Fluid fázisos pinocitózis: oldott részecskék a plazma membrán invaginációiból lefűződött endocitotikus vezikulákkal jutnak be a sejtbe. Adszorptiv pinocitózis. A kisméretű részecskék a plazmamembránhoz kötődnek (adszopció), kis koncentrációban, hatékony felvétel, DE nem specifikus. (nem specifikus kötőhelyek) Receptor-mediált pinocitózis vs endocitózis: specifikus receptorok a membránban; hatékony, specifikus felvétel; szelektív; koncentratív

Receptorok

Endocitotikus útvonalak Phagocytosis („sejt evés”): >0,25µm Pinocytosis („sejtivás”) Macropinocytosis: >1µm Endocytosis clathrin-burkos vesiculák közreműködésével: ~120nm Endocytosis caveolákkal: ~60nm Clathrin-és caveolin és/vagy dynamin independens endocytosis : ~90nm Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003); doi:10.1038/nature01451 <> Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Figure 1 Multiple portals of entry into the mammalian cell. The endocytic pathways differ with regard to the size of the endocytic vesicle, the nature of the cargo (ligands, receptors and lipids) and the mechanism of vesicle formation. Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003)

Macropinocitózis

Endocitotikus útvonalak Fagocitózis („sejt evés”): >0,25µm Pinocytosis („sejt ivás”) Makropinocytosis: >1µm Endocitózis clathrin-burkos vezikulák közreműködésével: ~120nm Endocitózis caveola-k közreműködésével: ~60nm Clathrin-és caveolin és/vagy dynamin independens endocytosis : ~90nm Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003); doi:10.1038/nature01451 <> Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Figure 1 Multiple portals of entry into the mammalian cell. The endocytic pathways differ with regard to the size of the endocytic vesicle, the nature of the cargo (ligands, receptors and lipids) and the mechanism of vesicle formation. Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003)

Receptor-mediált endocitózis Clathrin-burkos vezikulák: kosár-szerű burok keletkezik a vezikulák körül Clathrin: nehéz és könnyű lánc triskelion ötszögek és hatszögek

Clathrin burkos vezikulák közreműködésével végbemenő endocitózis A vezikula lefűződése dynamin (GTP-áz) közreműködésével Ligand kötődik a receptorhoz adaptin fehérjék clathrin összekapcsolódás („kosár” ) keletkezése. GTP-kötő fehérje: dynamin membrán fúzió vezikula lefűződés. A clathrin burok disszociációja a vezikuláról.

Clathrin burkos vezikulák közreműködésével végbemenő endocitózis

Clathrin-burkos struktúrák fagyasztva-tört, mély-maratásos technikával Heuser technika clathrin-burkos vezikula clathrin-cburkos öböl (pit)

Endocitotikus útvonalak Phagocytosis („ sejt evés”): >0,25µm Pinocytosis („sejtivás”) Makropinocitózis: >1µm Endocytosis clathrin-burkos vesiculák közreműködésével: ~120nm Endocitózis caveola-kal ~60nm Clathrin-és caveolin és/vagy dynamin independens endocitózis : ~90nm Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003); doi:10.1038/nature01451 <> Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Figure 1 Multiple portals of entry into the mammalian cell. The endocytic pathways differ with regard to the size of the endocytic vesicle, the nature of the cargo (ligands, receptors and lipids) and the mechanism of vesicle formation. Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003)

Caveola-k közvetítésével végbemenő endocitózis Caveolae: d: 50-100nm palack-ill omega-alakú membrán befűződések Dr L. Kiss Anna felvétele Dr L. Kiss Anna felvétele

caveolae

Caveolák: caveolin-tartalmú lipid raftok Erősen hidrofób membrán domének: koleszterin, sfingolipidek, glikozil-foszfatidil-inozitol; lipid raftok Caveolin: caveolin-1 caveolin-2 caveolin-3 Cavin (PTRF)

Caveola-k közvetítésével végbemenő endocitózis SV40 virus felvétele: caveola-k közreműködésével Virus kötődik az MHC I –hez (a gazdasejt membránján) MHCI (receptor a virus számára) caveola-kban Caveolin erőteljesen foszforilálódik (Src kináz, tirozin foszforiláció) A kortikális citoszkeleton átrendeződik (aktin filamentumok) aktin-”farok” Dynamin (kis GTPase) kötődik a caveola-k nyaki részéhez GTP hidrolízis caveola lefűződik

Endocitotikus útvonalak Fagocitózis („sejt evés”): >25µm Pinocytosis („sejtivás”) Makropinocitózis: >1µm Endocytosis clathrin-burkos vesiculák közreműködésével : ~120nm Endocitózis caveola-k közreműködésével: ~60nm Endocitózis : clathrin- és caveolin-independens és/vagy dinamin independens: ~90nm Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003); doi:10.1038/nature01451 <> Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Figure 1 Multiple portals of entry into the mammalian cell. The endocytic pathways differ with regard to the size of the endocytic vesicle, the nature of the cargo (ligands, receptors and lipids) and the mechanism of vesicle formation. Regulated portals of entry into the cell SEAN D. CONNER AND SANDRA L. SCHMID Nature 422, 37 - 44 (06 March 2003)

Az internalizált receptorok sorsa Az internalizált ligand sorsa A.) Reciklizáció a sejtfelszínre: vezikuláris transzporttal, a ligand a korai endoszómábn marad. (receptor recycling). pl: LDL receptors. B.) eljutnak a késői (late) endoszómákhoz és degradálódnak a lizoszómákban. (receptor downregulation). pl: EGF receptor (epithelial growth factor with its receptor). Az internalizált ligand sorsa Degradáció: a lizoszómákkal: korai (early) endoszóma – késői (late) endoszóma – lizoszóma útvonalon vagy: Recirculáció vissza a sejtfelszínre: korai endoszómában a ligand kötve marad a receptorához, visszajut a sejtfelszínre a receptorral együtt. pl: transferrin (vas-transzportáló fehérje).

Transzcitózis Makromolekulák transzportja a sejten keresztül intakt formában. Endocitózis → vezikuláris transzport → early endoszóma→ vezikuláris transport → exocitózis A receptor-mediált endocitózis speciális formája: a felvett molekula elkerüli a lizoszómális degradációt.

Transcitózis Clathrin burkos vezikulák!!  példa: Az anyai IgG felvétele és transzportja az újszülöttek bélhámsejtjein keresztül. a magzati placenta hámsejtjein keresztül. IgA molekulák felvétele és transzportja a hámsejteken keresztül. Clathrin burkos vezikulák!! 

Transzcitózis A kapilláris endothelen keresztül Caveolae!!

Vezikuláris transzport 2 fő mozzanat: - a vezikulák lefűződése: szignálok, burok fehérjék - a vezikulák célmembránhoz való kikötődése és fúziója: felismerő molekulák, fúziós fehérjék

Rab fehérjék kihorgonyozás dokkolás fúzió

Vezikuláris transzport Vezikula képződés: burok fehérjék: COPI, COPII: ER-Golgi clathrin: plazmamembrán, lizoszómális enzimeket szállító vezikulumok caveolin kis mol . súlyú G-fehérjék: GDP/GTP-kötő fehérjék: Rab fehérjék: „azonosító” fehérjék ER-Golgi között: ARP (donor membránban a COP fehérjékkel együtt) ARF: molekuláris kapcsoló (GTP-kötött állapotban: burok feh.- membrán asszociáció GDP-kötött állapot: burok leválik, fúzió létrejöhet) Vezikulák kihorgonyozódása, fúziója: fúziós fehérjék: SNARE bimbózás kihorgonyozás dokkolás fúzió horgony fehérje

Vezikuláris transzport kihorgonyozás kihorgonyozó faktor dokkolás A burok elvesztése bimbózás fúzió lefűződés

Membrán fúzió transz-SNARE komplex fúziós fehérjékkel együtt víz kiszorítás membrán fúzió

Textbook: Essential cell biology, p. 522-529 + lecture, (summarized in the present ppt presentation). Sources of figures:  Röhlich: Szövettan, 3rd ed., Semmelweis, Budapest, 2006  Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. ed., Garland Science  Own specimens, micrographs and drawings (P. Röhlich) Robbins: Basic Pathology, 7. edition, Saunders, 2003 Wikipaedia