Szövettani technikák, általános festési és immunhisztokémiai módszerek Makromolekulák azonosítása szövettani metszeteken Zsiros Viktória zsiros.viktoria@med.semmelweis-univ.hu Semmelweis Egyetem Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet Egészségügyi ügyvitelszervezői szak 2015. 12. 01. Hematoxilin-eozin, immunhisztokémia, in situ hibridizáció, vérkenet, vér

Mikrotechnikai alapismeretek Cél: a biológiai anyag mikroszkópos megfigyelése Előkészítő eljárások szükségesek: kellő vékonyságú, átvilágítható metszetek létrehozása kontrasztosítás, illetve festés   Fontos: Az előkészítési folyamatok során az élő anyag strukturális és funkcionális sajtságainak megőrzése, a lehető legkevesebb torzulás előidézése.

Minta előkészítés lépései 1.) Fixálás (anyagpreparálás és rögzítés): az élő anyag strukturális és kémiai stabilizálása (immerziós vagy perfúziós). 2.) Kimosás: a rögzítőszer eltávolítása vízzel, vagy egyéb oldószerrel. 3.) Víztelenítés (dehidrálás): a szövet víztartalmának vízelvonószerekkel történő kivonása és azokkal való helyettesítése abból a célból, hogy a biológiai anyag a nem vízoldékony, többnyire nagy viszkozitású beágyazóanyagokkal, illetve azok szerves oldószereivel (=intermedier anyagok) átitatható legyen. Utána derítés xilol-lal. 4.) Beágyazás: a vizsgálandó anyag folyékony beágyazószerekkel történő átitatása és a beágyazásra használt közeg kikeményítése. A kikeményített, beágyazószerrel átitatott és körülvett anyagot nevezik blokknak. A blokk mechanikai tulajdonságai olyanok, hogy belőle megfelelő vékonyságú metszetek nyerhetők. 5.) Metszet készítés: a blokk felszeletelése a vizsgálat céljából és az alkalmazott mikroszkóp fajtájától függően a kívánt vastagságban mikrotommal. 6.) Festés: a szövetelemek fény–, illetve elektronszórásbeli különbségeinek növelése. 7.) Lefedés: elzárni a levegőtől a metszetet, üveggel történő lefedéssel.

Festési eljárások I. A vizsgálat előtt minden sejt- vagy szövettani készítményt (leszámítva a pigment tartalmú sejteket), a vizsgálat kívánalmainak megfelelően meg kell festeni! Különböző festékek meghatározott makromolekulákhoz és ezeket tartalmazó sejt- illetve szövetkomponensekhez kötődnek. Élő állapotban és festési eljárások nélkül csak speciális optikai eszközökkel lehetséges egy biológiai minta megfigyelése. Erre alkalmas a fáziskontraszt és differenciális interferenciakontraszt (DIC), valamint sötét látóterű mikroszkóp. A fáziskontraszt-mikroszkóp abban az esetben használható, hogyha a minta vastagsága nem haladja meg a 10–12 μm-t. Ezzel az eljárással jól látható a sejtmag, és számos sejtorganellum. Nomarski optikával (DIC) fényképezve, 3D kép benyomását kelti, jó a felbontó-képessége, kiváló tájékozódást nyújt a preparátumon.

Festési eljárások II. Vitális festés: Élő sejtek különböző struktúráit vitális festésekkel tehetjük láthatóvá. A „vitális” szó azt jelzi, hogy az adott festék nem pusztítja el a sejtet. Amennyiben ezek a festékek egyben sav-bázis indikátorok is, az eljárás során funkcionális következtetéseket is levonhatunk. Az adott minta vizsgálatát, az alkalmazott festékektől függően, fénymikroszkóppal vagy fluoreszcens mikroszkóppal is végezhetjük. Vitális festék pl. a neutrálvörös vagy az acridinorange. Általános festés: pl. H-E. Általános, áttekintő jellegű a festés, a szövet minden részét megfesti, nem maradnak festetlen területek. Trikróm festés: A festési eljárás során három festékkel is megfestjük a metszetünket. Specifikus eljárások→hisztokémiai eljárások: fehérjék, enzimek, egyes ionok stb. szöveti lokalizációjának meghatározása.

Néhány alapfogalom Bázikus festék: Kationokban gazdag festék. A sejtek, szövetek savas természetű (szabad negatív gyököt tartalmazó) komponenseihez kötődik. Pl: Hematoxilin, toluidinkék, metilénkék. Bazofil anyag: bázikus festékkel színezhető struktúrák összefoglaló neve. Bazofil festődés: A bazofil anyag és bázikus festék reakciójának pozitív eredménye. pH-függő jelenség. Acidofil anyag: savas jellegű festékkel színezhető. Acidofil festődés: acidofil anyag és savas festék pozitív eredménye. Szintén pH függő. Eozinofília: Acidofílián belül megkülönböztetjük az eozinnal történő festést. Ortokromázia: A festék bizonyos komponenseket a saját színével megegyezőre fest (estleg az árnyalat más). Metakromázia: A festék bizonyos komponenseket a saját színétől eltérő színnel fest meg.

Általános festések (áttekintő festések)

Hematoxilin-eozin Leggyakoribb festési eljárás! Hematoxilin: liláskék szín DNS→sejtmag RNS→ durva felszínű endoplazmás reticulum (DER) Eozin: rózsaszín (eozin vörös) citoplazma kollagén izomrostok Párhuzamos metszetek festődése hematoxilinnal (A), eozinnal (B) és a két festék együttes alkalmazásával (C) (emlős, izmos falú kisartéria). http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/SzovettaniEsSejttaniVizsgaloModszerek/book.pdf

Fehér zsírszövet sejtmag: fekete, kék dER: sötétlila citoplazma és EC kollagén: rózsaszin, vöröses

Toluidinkék Ortokromázia!! Toluidinkék : kékszín bázikus festék főleg félvékony metszetek DNS→sejtmag RNS→ durva felszínű endoplazmás reticulum (DER) Ortokromázia!! Retina toluidinkékkel festett metszete

Toluidinkék Metakromázia Magasabb pH-n DNS, RNS, + savas fehérjék→kék pH függő! Magasabb pH-n DNS, RNS, + savas fehérjék→kék Savas proteoglikánok→vörös ibolya Metakromázia magyarázata A metakromáziás festődés mechanizmusa feltehetően az, hogy egyes makromolekulák felületükön festékmolekulákat adszorbeálnak. Ha a makromolekulák felületi festékkötő helyeinek rendeződése olyan, hogy a festékmolekulák aggregálódását is lehetővé teszik, a festékmolekulák adszorpciós polimerizálódása következik be. A metakromázia tehát bizonyos szabad gyökök periodikus felületi elrendeződéséhez kötött jelenség. Fizikai alapja az, hogy a polimerizált festékmolekula és a monomerek oldatának fényabszorpciós maximuma egymástól eltérő. Porc toluidinkékkel festett metszete, alapállomány (chondroitin-szulfát) metakromáziásan lilára festődik

(makromulekulák kimutatása) Speciális festések (makromulekulák kimutatása)

Kötőszöveti rostok kimutatása Azan-festés → Trikróm-festés: Azokármin–> magfestés -> piros Anilinkék –> kötőszöveti alapállomány, porcszöv., nyáktermelő mirigy, kollagén rostok -> kék Orange-G –> sejtplazma, sejtorganellumok -> narancs Orcein-festés → elasztikus rostok Tengerimalac bőr (Azan-festés) Artéria keresztmetszet (orcein festés)

Nukleinsavak kimutatása Pl.: DAPI (2,4 diamidino-2-fenilindol) festés: univerzális DNS-hez kötődő fluoreszcens festék, DNS-tartalmú struktúrák kékre festődnek (DAPI szűrőt használva a fluoreszcens mikroszkóppal). Retina metszet DAPI-val festve

Szénhidrátok kimutatása Perjódsav-Schiff (PAS)-reakció: Nem általános festés. A módszer glikogén, proteoglikánok és nyálkaanyagok, mukopoliszacharidok kimutatására való, és így pl. kitűnően festi a bélbolyhokban lévő nyálkatermelő kehelysejtek váladékát, az alaphártyát, a porcok alapállományát, a rugalmas rostokat és a nyálmirigyekben a nyálkatermelő (mucinosus) végkamrákat. A festődő struktúrákat PAS pozitívnak nevezzük. Az eljárás során az említett makromolekuláris anyagokban lévő alkoholos csoportokat perjódsavval aldehiddé oxidáljuk, majd az aldehideket a fukszint tartalmazó úgynevezett Schiff-reagenssel mutatjuk ki. Mucinózus mirigyvégkamrák PAS festődése: Glikogén, keményítő, (cellulóz) -> lila Sejtmag -> kék (hematoxil-eozin utánfestés miatt)

Lipidek kimutatása Pl.: Szudán III. festés Fixálás: fagyasztással! Liped réteg a víz tetején+ szudán festés Epesók hatása Hematoxilin-eozin festés: a sejtben található egyetlen nagy zsírcsepp a sejtmagot ellapítja, és kiszorítja a perifériára. Fixálás és beágyazás során a zsírcseppek kioldódtak!! Szudán III. festés: zsírsejtek zsírcseppjei narancssárgák.

Enzimek kimutatása    Tehát: Ezek az eljárások azon alapszanak, hogy a minta- vagy metszetkészítés során alkalmazott procedúra ellenére a preparátumban maradnak ép, működőképes enzimek, ezek megfelelő körülmények között aktiválhatók, és szubsztrátjuk hozzáadásával oldhatatlan, színes csapadékot képeznek. Ennek helye az enzim jelenlétét bizonyítja, illetve lokalizációját jelzi. Tehát: enzim aktivítás detektálása (nem magának a fehérjének a detektálása) a hozzáadott szubsztrátból keletkező termék oldhatatlan csapadékot képezzen (a keletkezés helyén), vagy mi tesszük azzá lecsapó reagens alkalmazásával a keletkező csapadék fény- vagy elektronmikroszkóposan detektálható az enzim aktivitásának helyén   

Enzimek kimutatása Gömöri-féle festés: lúgos foszfatázok kimutatása: A Gömöri György által kidolgozott nehézfémsós módszerek a szubsztrátumról lehasított foszfát- vagy szulfátionok láthatóvá tételén alapulnak. A foszfatáz nevű enzimek szerves foszfátésztereket hasítnak. A savas és a lúgos foszfatázok pH-optimuma eltér. Gömöri-féle festés: lúgos foszfatázok kimutatása: I. Enzimek hatására lehasadó foszfátionok és Ca++ -ionok: (lecsapóreagens) = CaHPO4 (színtelen) keletkezik II. Kobald sóoldat alkalmazása: Patkány vese részlet Gömöri féle festés: lúgos foszfatáz kimutatása. Az enzim aktivitás helyén fekete színű kobalt-szulfid csapadék keletkezik. CaHPO4 + Co++ CoHPO4 + Ca++ III. színtelen (NH4)2S alkalmazása: CoHPO4 + S CoS + HPO4 fekete

Immunhisztokémia és immuncitokémia a „keresett” fehérje kimutatása sejttípusazonosítás

Alapfogalmak Antigén: mindazok a struktúrák, amiket az immunrendszer felismer (általában sejtfelszíni fehérjék vagy poliszacharidok) Antitest / immunglobulin (Ig) /ellenanyag: plazmasejtek által termelt (DE! B-sejtek felszínén receptor komplexben is) polipeptid, amely egy meghatározott fehérje, meghatározott részletét (3-4 aminósavból álló egység, úgynevezett epitóp) ismeri fel antitest (A) különböző antigének a sejtfelszínen antigén-antitest kötődés sejtfalon lévő antigének baktérium antitest (B)

Humorális immunválasz (ellenanyag közvetített immunválasz): Az antigént specifikusan felismerő B sejtek osztódnak, majd plazmasejtekké differenciálódnak, amelyek nagy mennyiségben termelik az antigént fajlagosan felismerő ellenanyagot. Az antitesttel „megjelölt” antigént, már az immunrendszer egyéb sejtjei könnyen felismerik és „megsemmisítik” (fagocitózis, sejtlízis indukció).

Immunglobulin molekulák (antitestek) általános jellemzői http://www.tankonyvtar.hu

Ismert fehérjét felismerő antitestek előállítása „mesterségesen” Egy élő szervezetet (egér, nyúl, kecske) használunk fel, a vizsgálni kívánt fehérjét felismerő antitest megtermeléséhez. Egereket beoltjuk a vizsgálni kívánt fehérjénkkel. 1 Az egérben a fehérjére specifikus antitestet termelő B sejtek alakulnak ki. 2 Ezeket a B sejteket izoláljuk az egér szervezetéből és egy tumorsejttel fúzionáltatjuk, hogy halhatatlan legyen. 3 Sejttenyészetben a halhatatlan B sejtek a megfelelő antitestet termelik. 4

Immunhisztokémia és immuncitokémia Alkalmazása: Konkrét fehérje lokalizációjának / vizualizációjának vizsgálatára alkalmas. Szerv, szövet, sejttenyészet szinten (fény-, és konfokális mikroszkóphoz) → immunhisztokémiai Szubcelluláris szinten (elektronmikroszkópos detektálás) → immuncitokémia Módszer: antigén-antitest kapcsolódásán alapul Előnye: magas specifitás, mert antigén-antitest kapcsolódáson alapszik Hátránya: A kötött ellenanyag mikroszkópban nem látható, jelölni kell egy mikroszkóposan is felismerhető jelzőanyaggal, „elő kell hívni” (fluorokróm, enzim, kolloidális aranyszemcse). Alapvetően minőségi paraméterek meghatározása, de denzitometria segítségével mennyiségi paraméterek is mérhetőek. Kromofórok: általánosságban azok a molekulák, vagy molekularészletek, amelyek képesek a látható spektrumból meghatározott hullámhosszúságú fényt abszorbeálni. Fluorokrómok: azok a vegyületek, amelyek megvilágítva, az őket fotonok formájában elérő energiát nem nyelik el véglegesen, hanem ezt felvéve gerjesztett állapotba kerülnek, majd igen rövid idő múlva a felvett energiát más hullámhosszú fény formájában kisugározva visszatérnek az alapállapotukba. A folyamat második felének (a gerjesztett állapotból az alapállapotba való visszatérés) történéseit fluoreszcenciának nevezzük.

Immunhisztokémiai jelöléshez szükség van: Preparátum / metszett Keresett fehérje (antigén) Ellenanyag más néven antitest (a keresett antigént specifikusan ismeri fel) Kromogén (jelmolekula) Megfelelő mikroszkóp     http://www.abcam.com/ 

Immunhisztokémiai jelölés 3.Sejtfelszíni antigént felismerő antitest jelzőmolekulával 4.Mi az antitesten lévő jelzőmolekulát (enzim esetén az aktivitása következtében keletkező terméket) látjuk 2.Sejt, felszínén sok az adott sejtre jellemző molekula 1.Szövet / kenet rengeteg sejttípussal

Direkt immunhisztokémia Az antigénhez kötődött antitestet láthatóvá kell tenni! 2 megoldás. 1. Direkt immunhisztokémia: A primer antitesthez kötünk jelölőmolekulát. Előny: pontos lokalizáció, kevésbé idő-, és munkaigényes Hátrány: magas háttér, kisebb jel, jelerősítés nem építhető be, drága

Indirekt immunhisztokémia 2. Indirekt immunhisztokémia: A primer antitestet felismerő szekunder antitest hordozza a jelölőmolekulát. Előny: alacsony háttér, relatív alacsony költség, reakció belső erősíthetősége Hátrány: munkaigényes, lassú procedúra, kevésbé pontos lokalizáció Pimer antitest: az antigént specifikusan ismeri fel Szekunder antitest: a primer antitestet ismeri fel faj / ízotípus specifitás alapján (vagyis az alapján, hogy milyen állatban lett a primer antitest megtermelve) Példa az antitestek származására: 1. állat 2. állat 3. állat egér nyúl kecske antigén anti-egér Ig anti-nyúl Ig

Immunhisztokémiai reakciók előhívása (jelölő molekulák) Fluorokrómok Enzimek Közvetlenül kapcsolt Közvetetten biotin által (ABC komplex) Immunarany Direkt jelölés esetén: primer antitest Indirekt jelölés esetén: szecunder antitest

Immunhisztokémiai reakciók előhívása (jelölő molekulák) I. Fluorokrómok: Meghatározott hullámhosszúságú fénnyel megvilágítva, adott hullámhosszúságú fényt emittálnak. Legismertebb: FITC (Fluorescein isothiocyanate) Előny: kettős jelölés alkalmazása, pontosabb lokalizáció Hátrány: fluoreszcens mikroszkóp, hamar „kifakul” Tubulin festés (zöld) Magfestés (kék) Meiozis II (egér)

Immunhisztokémiai reakciók előhívása (jelölő molekulák) II. Enzimek: A szubsztrátot hasítva oldhatatlan, színes csapadék képződik Enzim: peroxidáz (H2O2-t bont) Szubsztrát: kloronaftol (4-chloro-1-naphthol)→ kékes lila DAB (diaminobenzidine)→barna csapadék Előny: látható fénnyel detektálható (fénymikroszkóp), jelerősség az előhívás idejével erősíthető, lassan fakul Hátrány: kettős immun szinte lehetetlen, mérgező vegyületek! Madár lép B sejt jelölés kloronaftolos előhívás

Immunhisztokémiai reakciók előhívása (jelölő molekulák) III. Immunarany jelölés: az antitesthez (primer vagy szecunder) kolloidális aranyszemcsét kötnek (1nm-20nm). Antitest kötődése elektronmikroszkóposan detektálható. Az arany erősen elektronszóró→sötét pontokként jelennek meg. Előny: nagyon pontos sejtbeli lokalizáció, kettős immun alkalmazása. Hátrány: csak elektronmikroszkópos detektálás Caveosoma elektronmikroszkópos képe: Anti-Caveolin-1 antitest, kolloidális aranyszemcsével láthatóvá téve

Többszörös immunfloureszcens jelölések Kettős immun jelölés: Két célmolekula kimutatása egyazon sejten. A fluorokrómok gerjesztési és emissziós hullámhossza eltérő legyen. Kolokalizáció=együttes előfordulás Hármas immun jelölés: Endothel sejttenyészet vörös: tubulin (Texas Red) zöld: aktin (FITC) kék: DNS (DAPI) DAPI: DNS A-T gazdag régiójához köt

Diagnosztika Terhességi teszt (HCG elleni antitest) Malignus elváltozások típusának meghatározása (monoklonális antitest terápia) Vércsoport szerológia Kórszövettani-szövettani diagnosztika

In situ hibridizáció

Nukleinsavak kimutatása: In situ hibridizáció DNS/RNS szekvenciák kimutatása, lokalizációjuk meghatározása (szövet, sejt, kromoszóma szinten) Alkalmas Génkifejeződés vizsgálata (mRNS) Vírusfertőzés azonosítására és lokalizációjára (RNS és DNS vírusok is) Kromoszóma térképezés (DNS) Génhiba,mutáció kimutatása (DNS) Alapja: Egyszálú nukleinsav-nukleinsav komplementaritás elve alapján történő kapcsolódása Próba:olyan oligo-, vagy polinukleotid szekvencia, amely a bázispárosodás szabályai szerint egy jól meghatározott (azaz a keresett) szekvenciához (DNS-hez, vagy RNS-hez ) hibridizál. A próba lehet DNS vagy RNS.

Próba jelölési módjai Radioaktív fluorokróm oligonukleotid próba DNS Radioaktív Színreakción alapuló immunhisztokémiai detektálás (biotin, digoxigenin, fluoreszcein) Aranyszemcse Fluoreszcens digoxigenin oligonukleotid próba DNS enzim antitest enzimmel konjugált anti-digoxigenin DNS színes csapadék szubsztrát DNS

Források: H.-Minkó Krisztina: Vér és Immunsejtek, nyirokszervek című előadása Kocsis Katalin: Vérfejlődés, Hemopoesis című előadása Röhlich Pál szerkeszette Szövettan (SE) Gergely János és Erdei Anna által szerkesztett Immunbiológia (ELTE) Zboray Géza: A keringési szervek (ELTE jegyzet) Molecular cell biology, Lodish et al. Molecular biology of the cell, 5. kiadás Alberts et al. http://www.emedinfo.com/blood-cells.html Dr. Magyar Attila és Dr. Nagy Nándor előadásai http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/SzovettaniEsSejttaniVizsgaloModszerek/book.pdf Képek: internet, Google

Egy kis érdekesség Mire lehetnek még jók a fluoreszkáló fehérjék? http://www.origo.hu/tudomany/20081008-kemiai-nobeldij-2008-gfp-zoldesen-fluoreszkalo-feherje.html http://scienceblogs.de/lindaunobel/2009/07/02/a-manycolored-glass-the-glow-of-life-and-the-joy-of-discovery/

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!