Új molekuláris biológiai módszerek labor Tervezési feladat Tárgyfelelős: Dr. Wunderlich Lívius Készítette: Czobor Ádám, Hajdinák Péter

A feladat áttekintése Háttéradatok gyűjtése Az adott fehérje ismertetése A szükséges gén megkeresése Konstrukció és expresszió megtervezése Vektorok és endonukleázok kiválasztása PCR primerek és reakció tervezése, termék tisztítása A kész vektorok létrehozása, transzformálása, ellenőrzése Az expresszió megtervezése, a termék kinyerése, tisztítása A géntermék ellenőrzése, esetleges módosítása

Háttéradatok gyűjtése I. A fehérje bemutatása A fehérje mérete, szerkezete (poszttranszlációs módosítások) A fehérje funkciója (élettani szerep, felhasználás) 165 AS 2 diszulfid-híddal MW: kb. 30000 Dalton Szénhidráttartalom: kb. 40%

Háttéradatok gyűjtése II. A szükséges gén megkeresése Internetes adatbázisok (pl: NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov ) Intron, exon beazonosítás cDNS A gén adatainak megadása: Accession number (link) Méret Gazdaszervezet AA szekvencia (ellenőrzés végett)

Konstrukció és expresszió megtervezése I Konstrukció és expresszió megtervezése I. Vektorok és endonukleázok kiválasztása Bakteriális expresszió baktérium plazmid Szelekció (antibiotikum, pl.: Amp) Riporter gén (pl.: LacZ) Indukció (pl.: IPTG) Tisztítás (tag) Egyéb lehetőségek (pl.: antitest, fluorofór) Alkalmazandó törzs (klónozó, expressziós) http://products.invitrogen.com/ivgn/product/V35120 Endonukleázok ((1) vagy 2 darab) Génen nincs hasítás!!! Plazmidon hasítás CSAK a MCS-ban

Konstrukció és expresszió megtervezése II Konstrukció és expresszió megtervezése II. PCR primerek és reakció tervezése, a termék tisztítása Primerek (hasítóhelyek kialakítása) START, STOP kodon meglétének ellenőrzése (plazmidon) Méret: hasonló méret, kb. 15-25 bp (specifikusság) Olvadáspont ellenőrzése (max. 3-5°C eltérés) tapadási hőmérséklet Hajtűképzés elkerülése (egymás utáni, ill. láncvégi G,C-k) Komplementáció elkerülése (dimer képzés minimalizálása) 5’-3’ irányultság! Reakció megtervezése Tapadási hőmérséklet A paraméterek (idő, hőmérséklet) beállítása a gyártó által megadottak alapján (polimerizációs idő gén mérete) https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator#.UJgIAMWCD4Y

Konstrukció és expresszió megtervezése III Konstrukció és expresszió megtervezése III. PCR termék tisztítása, kinyerése Agaróz gélelektroforézis Teljes preparátum Teszthasítás – több enzim, több kombináció biztosabb eredmény (kis mennyiség) Normál hasítás (nagy mennyiség, kíméletes bánásmód, csak a szükséges enzimek) Visszanyerés (gélből tisztítás)

Konstrukció és expresszió megtervezése IV Konstrukció és expresszió megtervezése IV. A kész vektorok létrehozása, transzformálása, ellenőrzése Ligálás Tisztított, hasított (beillesztéshez szükséges módon) PCR termék Hasított (beillesztéshez szükséges módon) plazmid Ligáz enzim (pl. T4) A gyártó által megadott módon. Koncentráció/méret egyeztetése. Transzfomálás Kompetens sejt (klónozó törzs – fenntartás/szaporítás, fagyasztás) A ligálás terméke A gyártó által megadott módon. Ellenőrzés Szelekciós tápközeg (szélesztés) Miniprep (kit) Hasítások + agaróz gélelektroforézis; szekvenálás

Konstrukció és expresszió megtervezése IV Konstrukció és expresszió megtervezése IV. A kész vektorok létrehozása, transzformálása, ellenőrzése Az ábrák SerialCloner programmal készültek.

Konstrukció és expresszió megtervezése V Konstrukció és expresszió megtervezése V. Expresszió megtervezése, a termék kinyerése, tisztítása Transzformálás expressziós törzsbe Ellenőrzött, inszertet tartalmazó plazmid (miniprep) Expressziós törzs (kompetens sejt) A gyártó által megadott módon. Fehérje termeltetése Sejtszaporítás (szelekció) Indukció (pl. IPTG) A termeltetett fehérje tisztítása (koncentrálása) Affinkromatográfia (extra régiók eltávolítása?) Membránszűrés Dializálás

A géntermék ellenőrzése, esetleges módosítása Mennyiségi elemzés Fotometria: 280 nm Reagens felhasználásával (pl.: Coomassie) A gyártó által megadott módon. Minőségi elemzés PAGE/SDS-PAGE (+ több dimenziós, gradiens) Aminosav analizátor Tömegspektrometria (pl.: LC-MS) Kombinált minőségi és mennyiségi elemzés Western blot Termék módosítása Az extra szakasz eltávolítása Plazmidfüggő módszer. A gyártó által megadottak szerint.

Összefoglalás Háttéradatok gyűjtése Adatok, szekvenciák Konstrukció és expresszió megtervezése Alapanyagok Vektor létrehozása (inszert, plazmid) Klónozás Expresszáltatás, tisztítás A géntermék ellenőrzése, esetleges módosítása Mennyiségi és minőségi analízis Extra szakasz eltávolítás

Formai követelmények Elrendezés: Fedőlap; tartalomjegyzék + a kiadott mintajegyzőkönyv alapján; oldalszámozás a lap alján Betűtípus: Times New Roman; betűszín: fekete Főfejezet címe: 16 pt; félkövér Alfejezet címe: 14 pt; félkövér; (esetleges további alfejezet: 13 pt; dőlt) Szöveg: 12 pt; sorkizárt Sorköz: 1,5 sor

Beadás Beadási határidő és formátum A beadás határidő 2017.11.19. (éjfél). A kész tervezési feladatot PDF formátumban Czobor Ádámnak (adam.czobor@mail.bme.hu) kell elküldeni (e-mail). Egyéb A feladatot önállóan kell megoldani! Más munkájának másolása, illetve régebbi tervezési feladatok felhasználása büntetést von maga után! A tervezési feladat során felhasznált irodalmi adatokat minden esetben hivatkozással kell ellátni. A felhasznált szekvenciák (nukleinsavak, fehérjék) link-jét mindig meg kell adni. A tervezési feladat során (elméletben) alkalmazott vegyszerek, enzimek, vektorok, kit-ek gyártóját és pontos nevét minden esetben meg kell adni, illetve az adott termék link-jét is be kell másolni a tervezési feladatba.

Köszönjük a figyelmet! E-mail címek: livius@mail.bme.hu adam.czobor@mail.bme.hu hajdinak@mail.bme.hu