TIHANYI NIKOLETT, RANDEK JUDIT SZŰRŐELEMEK A BIOTECHNOLÓGIÁBAN

Szűrés jellemzői A szűrés nyomáskülönbség (mint hajtóerő) hatására végbemenő szétválasztó művelet,mely során szilárd halmazállapotú anyagot folyékony vagy légnemű közegtől szétválasztunk Nyomáskülönbség előidézhető: Gravitációs úton Szivattyúval Vákuumszivattyúval Két alaptípus: Felületi szűrés Mélységi szűrés

Szűrés jellemzői Felületi szűrés: a teljes felületen tartják vissza azokat a részecskéket, amelyek mérete nagyobb a szűrő pórusméreténél Ehhez tartozik az abszolút szűrés fogalma: visszatartást csak a membrán pórusainak átmérője határozza meg. Mélységi szűrés: a részecske visszatartása a felületen és a szűrő teljes vastagságában történik Valószínűségi szűrés elv alapján történik mivel mindig van egy adott valószínűsége annak, hogy egy részecske átjut a szűrőrétegen. Ezért a gyártó a mélységi szűrőt névleges pórusmérettel jellemzi.

A szűrés jellemzői Statikus (dead end) szűrés Szűrendő anyag a membrán felületére merőlegesen érkezik. Nagyobb méretű molekulák visszamaradnak(koncentráció polarizációs réteg).Ez is szűrőréteget képez Keresztáramú (cross flow) szűrés A fluidum a membrán felületével párhuzamos irányból érkezik, hajtóerő hatására a permeálódó komponensek merőlegesen haladnak át (nincs lerakódás  teljesítmény nő)

Szűrés jellemzése A szűrők hatékonyságát jellemezhetjük a százalékos visszatartással: β-hányados: befolyó anyag konc./ elfolyó anyag konc. (adott részecskeméretre) Titer csökkenés (T r ): β-hányados adott mikróbára nézve Szűrő anyaga lehet: Polipropilén Pammut Üvegszál Cellulóz Nylon Poliamid Teflon stb.

Szűrők felhasználása és követelményei Felhasználás Fermentorok, bioreaktoroknál felhasznált anyagok sterilezése Elfolyó anyagok tisztítása Sejt/sejtörmelék eltávolítása Termékek tisztítása Levegő/gáz szűrése stb. Követelmények: A felhasznált szűrőelem az adott üzemi körülményeknek feleljen meg (nyomás, hőmérséklet, áramlási seb. ) A szűrendő anyaggal legyen kompatibilis Megfelelő eltávolítási hatásfok Alaki és mechanikai feltételek Fix pórus méret Nagy terhelés esetén se legyen szerkezetváltozás v sérülés

Polipropilén mélységi szűrőbetétek Felhasználás: Előszűröként szérumok, vakcinák, diagnosztikai reagenseknél stb. Fermentációnál az oldószerekre, habzásgátlókra Downstream folyamatoknál sejt és sejttörmelék elválasztásra stb. Tulajdonságai: Nem foszló, folytonos PP szálakból áll (gyanta mentes) Pozitív töltésű típusú szűrők oldatokban képesek az abszolút pórusméretnél kisebb részecskéket is megkötni az elektrosztatikus kölcsönhatás által( pl.baktréiumokat, endotoxinokat) Két részből áll: belső résznél a pórusátmérő állandó (megfelelő visszatartás biztosítása ) Külső résznél szálak átmérője kifelé nő, ahogy a pórusátmérő is,a hézagtréfogat állandó

Polipropilén redőzött szűrőszövetek Felhasználás: előszűrő (víz, szérum,pufferek,oldatok stb.) Tulajdonságai: Folytonos nem szőtt PP szálakból Állandó pórusméret Kialakítása: a vékony PP szövetet egy henger alakú tokba hajtogatják bele, amit egy belső PP szilárdító mag és egy külső védőkosár fog közre Működési határ: 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C 410 kPa nyomáskülönbségig max 80 °C

Gyantamentes redőzött cellulóz szűrők Felhasználás: előszűrőként (üzemi-és mosó vízhez, RO membránhoz, ioncserélt vízhez stb.) Tulajdonságai. Felépítés: tiszta redőzött cellulóz szálakból nagy felületű hengerbe hajtogatva Működési határ: 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C 410 kPa nyomáskülönbségig max 80 °C

Gyantával kötött hajtogatott üvegszálas szűrők Felhasználás: membránokhoz előszűrőként, steril levegő, ozmózis berendezések védelme Tulajdonságai: az üvegszál természetes pozitív töltésének köszönhetően, a negatív töltésű részecskék, baktériumok, endotoxinok és kolloid anyagok leválasztása kimagasló. a pozitív töltésnek egy további előnye, hogy nemcsak a deformálódó, hanem a nem deformálódó részecskéket is képes leválasztani, valamint nagy mennyiségű szennyeződést képes felvenni A fenol gyanta és üvegszál kombináció előnyei:aszimmetrikus pórus szerkezet, rendkívül hatékony részecske visszatartás, a legszélesebb körű vegyi ellenállás, hosszú élettartam Autoklávozhatók

Porózus rozsdamentes acél szűrők Felhasználás: gőzsterilezés, oldószerek, víz stb. tisztítása Tulajdonságai: Felépítés: pórozus szerkezetű ( szinterelt fémrészecskék) Szennyeződés visszatartóhatása jelentős Nagy hőmérséklettűrés (max 200) Korrozióálló, kíváló kémiai kompatibilitás, legtöbb oldószerhez használható, jó szűrésikapacitás viszkózus anyagok esetén is Gázoknál tisztításánál 0,4- 11μm pórusméret jellemző Kémiailag/mechanikailag jól tisztítható (újrafelhasználható)

Membánszűrők Felhasználás: Levegő/gáz szűrése Oldatok sterilezése Biológiai anyagok tisztítása Tulajdonságai. Többféle polimerből készülhet: műanyag (poliamid, poliészter stb.),cellulóz- származék (cellulóz-nirát v. acetát stb.,),teflon-származék (PTFE) stb. Szerkezet: a membrán egy PP és PÉ réteg között van Előnyei: kémiailag egységes anyagokból készülnek, konstans pórusméret, szerves oldószerekkel, savval, lúggal szemben ellenállóak, szűrési veszteség kicsi, oldott anyag nem adszorbeál, konstans pórusméret Hátrányai: Túlnyomás v vákuum kell, sérülékenyek, változhat a pórusméret Egyrétegű (előszűrő) v. kétrétegű ( steril szűrő)

Hidrofil membrán szűrők Felhasználás : Előszűrőként vagy sterilszűrőként a diagnosztikai reagensekhez,szerves oldószerekhez, pufferekhez, szérumokhoz stb. Tulajdonságai: Anyaga lehet: tiszta nylon, módostított polimerek (poliamid, poliszulfon) Nedvesítőszerrel, felületaktívanyaggal vagy vmilyen bevonattal vannak ellátva, ezek leoldódhatnak a membránról, rontva a szűrő és a termék minőségét

Hidrofób membrán szűrők Felhasználás : Fermentorok és bioreaktorok be-és kimenő gáz sterilezéséhez, agresszív oldószerrekhez, aszeptikus csomagolásnál nitrogén és levegő sterilezéséhez Tulajdonságai: Kétrétegű hidrofób polivinilidén-flourid v teflon membrán két PP támasztóréteg között 100%-os baktérium és baktériofág visszatartási hatékonyság száraz és nedves körülmények között is Folyadékban az abszolút szűrőképesség 0,2 μm, levegő v. gázban 0,01 μm Többszöri in situ gőzsterilezést és autoklávozást jól bírja (165 h, 142 °C)

Kis fehérjekötő kapacitású membrán szűrők Felhasználás: Híg fehérje oldatokhoz ( kevesebb mint 1 mg/ml)(szérummentes táptalaj, fehérje alapú terápiás és diagnosztikai reagensekhez, rekombináns feh. stb.) Cél a min. fehérjeveszteség Tulajdonságai: Hidrofil típusú Anyaga: hidroxilezett poliamid, PVDF, poliszulfon és egyéb polimerek Kötőképessége: cm 2 -ként kevesebb mint 5 μg feh-jét köt meg

szűrőházak A biotech.-ban a szűrőházak anyaga rozsdamentes acél v. szénacél Követelmények: Megfelelő méret és kialakítás ( nyomáskülönbségek, hőmérs. és áramlási feltételeknek megfeleljen) Alkalmas legyen in situ gőzsterilezésre és a fluidomokkal való érintkezésre Belső felületek átlagos felületi érdessége 0,51-0,64 μm között legyen, amit elektropolírozással oldanak meg Korroziórezisztens felület (elektropolírozással) Könnyen tisztítható elemekből álljon Kondenzelvezetés biztosítása

Fermentációs levegő előszűrése Kompresszorok segítségével nagy nyomású levegő áramlás biztosítható Két féle kompresszor: Olajkenéses: a levegő előszűrése fontos az olajcseppek eltávolítása miatt Alkalmasak a gyantával kötött üvegszálas szűrők, amelyek a pozitív töltésük miatt akár 99,9 %-os hatékonysággal távolítják el a 0,01-0,5 μm –nél nagyobb víz-és olajcseppeket (koaleszcens szűrők)

Fermentációs levegő előszűrése Olajmentes kompresszor: szennyeződések és vízcseppek eltávolítása Alkalmas szűrőtípusok: cellulóz, PP vagy üvegszálas szűrők

levegő steril szűrése A levegőben lévő baktériumok és bakteriofágok, vírusok befertőzhetik a fermentlevet, ill. terméket Alkalmas szűrő típus a hidrofób membránok (víztaszító) 100%-os eltávolítási hatékonyság nedves vagy száraz körülmények között is Folyadékokra 0,2 μm abszolút szűrőképesség, levegőre 0,01μm

Elmenő levegő/gáz szűrése Cél: bioreaktorokból kikerülő oragnizmusok megakadályozása. Ezek aeroszol cseppek formájában távozhatnak a levegőárammal. Az aeroszolok mérete 1-5 μm, így a ciklonok nem tudják eltávolítani Ajánlott szűrő típus PP mélységi szűrő előszűrőnek (1,2 μm), ami eltávolítja az aeroszol részecskéket, a sejteket tartalmazó folyadélcseppeket és a kihabzást is megakadályozza Sterilszűrőként hidrofób membránszűrő (0,2 μm)

Folyékony alapanyagok szűrése A fermentációhoz felhasznált anyagokat ( víz, pufferek, tápanyagok, növekedési faktorok, habzásgátló) és a kész termékeket szűréssel sterilizálni kell (a hőérzékeny anyagok minősége ne romoljon) Alkalmazott szűrőtípusok: Előszűrő: PP mélységi szűrő Sterilszűrő: hidrofil membránszűrő

Mycoplasma és vírus eltávolítása a tápoldatból Szérumok és egyéb biológiai anyagok (növekedési faktorok stb.) tartalmazhatnak mycoplasmát és vírust, amivel befertőzhetik a sejteket Mycoplasma szűrése: hidrofil membrán szűrővel (0,1 μm) Plazmában és szérumban lévő vírusok eltávolítása szintén hidrofil membrán szűrővel ( 0,04 μm)

A fermentációs iparban használt szűrőtípusok

SZŰRŐELEMEK A DOWNSTREAM MŰVELETEKBEN Downstream műveletek: A fermentorból kapott anyagból nagy tisztaságú, szennyezőktől (endotoxin, baktériumok, részeckék és egyéb biológiailag aktív anyagok) mentes biológiailag aktív termék előállítása Műveletek: Sejt (főtömeg, maradék) és sejttörmelék eltávolítása Folyadék szűrése és tisztítása Termék tisztítása, koncentrálása, és sterilizálása membránszűréssel

ELSŐDLEGES (FŐTÖMEG) SEJT ÉS SEJTTÖRMELÉK ELTÁVOLÍTÁS Fermentlé nagy szárazanyag tartalma és viszkozitása: Problémák a kivitelezhetőséggel, hatékonysággal és a gazdaságossággal Inkább centrifugálás, keresztáramú mikroszűrés (CFF) Szűrőelemek is alkalmazhatóak: nagy kapacitású mélységi előszűrők (gyors eltömődés megelőzésére) Előnyök: Egyszerű és gyors használat Alacsony beruházási költség Könnyebb, gyorsabb tisztítás és sterilezés Minimális folyadék- és termékveszteség

ELSŐDLEGES (FŐTÖMEG) SEJT ÉS SEJTTÖRMELÉK ELTÁVOLÍTÁS Az iparban kombinálják a centrifugálással eltávolítják a szilárd anyag nagy részét, majd egy szűrőelem (1-2 µm alatt) Leggyakrabban pozitív töltéssel vagy töltéssel nem rendelkező polipropilén mélységi szűrőket alkalmaznak Emlős sejtek: 1-5 µm Baktériumok: 0,3-1 µm Nagy sejttörmelék koncentrációnál: nagy felületű gyantával impregnált üvegszálas/polipropilén redőzött szűrők: 0,7-2,5 µm

MÁSODLAGOS (MARADÉK) SEJT ÉS SEJTTÖRMELÉK ELTÁVOLÍTÁS Hozzájárul a nagyobb tisztasághoz, a szűrt folyadék sterilizálásához (immobilizált illetve mikrokarrier hordozó felületén növő sejteknél is) Koncentrációtól függően: Polipropilén mélységi szűrő (0,5 µm) Gyantával impregnált üvegszálas szűrő (1 µm) Hidrofil membránszűrő (0,45 vagy 0,2 µm) → sterilre ill. tükrösre szűrés

VÍRUSSZENNYEZÉS LEHETŐSÉGÉNEK CSÖKKENTÉSE Szennyezés: sejtkultúrából, szérumból vagy biológiai adalékanyagból Eltávolításuk: Az ultraszűrés sokszor nem alkalmazható, mert a fehérjéket is visszatarthatja Hidrofil membránszűrőkkel (0,04 µm) rögtön a kezdeti tisztítás után Magas fehérjekoncentrációjú fermentlé csökkenti a membránon történő adszorpció miatt bekövetkező veszteséget Kisebb aktivitás vesztés, mint a hőinaktiválásnál Gyors és egyszerű 28

KONCENTRÁLÓ ÉS TISZTÍTÓ RENDSZEREK VÉDELME Abszolút szűrők alkalmazásának előnyei: Védik a rendszert a korai eltömődéstől és a befertőződéstől Megnövelik a működési időt és lecsökkentik a takarítás és a cserélés gyakoriságának szükségességét Alacsony beruházási költség, gazdasági hatékonysága könnyen bizonyítható Előszűrőként (polipropilén mélységi és porózus rozsdamentes acél szűrők) csökkentik a drága membránszűrők, ultraszűrők és kromatográfiás oszlopok terhelését Oldószerek, pufferek és más folyadékok sterilre szűrésével megvédik az aszeptikus környezetet 29

A TERMÉK VÉGSŐ TISZTÍTÁSA ÉS STERILRE SZŰRÉS A termék tovább szennyeződhet a tisztítási lépések után (gyűjtőtartályok) Tisztaság és sterilitás megőrzése érdekében szükséges még egy utolsó tisztítás a termék végső csomagolása, tárolása előtt Alacsony fehérjekötő képességű hidrofil membránszűrőkkel (0,2 µm): Tápközeg maradványainak eltávolítására, végső szűrésre és sterilre szűrésre 30

SZŰRŐELEMEK A KISZOLGÁLÓ RENDSZEREKBEN Víz: Injekció minőségű vízhez (WFI), készülékek mosásához (CIP: cleaning-in-place), terméket tároló tartályok mosásához (WFI/DI), tisztított vízhez (PW) PP mélységi szűrő, hidrofil/hidrofób membránszűrők Vegyszerek és oldatok: Kristályosításhoz és tisztításhoz (aceton, alkoholok) Polipropilén mélységi és redőzött szűrő Levegő, nitrogén, egyéb gázok: Tartályok levegőztetéséhez, túlnyomás/vákuum biztosításához Keretes szűrő (redőzött polipropilén), hidrofób membrán Gőz: Tiszta gőzhöz (SIP: sterilization-in-place) Porózus rozsdamentes acél szűrő (1,2 µm) 31

SZŰRŐK GŐZSTERILEZÉSE In situ gőzsterilezés: Gőz: száraz, telített, szennyeződésmentes → rozsdamentes acél előszűrő Legalább 121 °C (100 kPa), 30 perc Elhelyezés: gőzkondenzátum el tudjon csorogni (szűrőházba ne), rövid steril csőhossz Minden csap és szelep kicsit nyitva (in situ) → zárni Gőz lezárása után inert nyomás a szűrőelemre (ellenirányú nyomás TILOS → integritás vesztés) Autoklávban sterilezés: Nem kondenzálható gázok eltávolítása Szűrőház teteje (a betéttel) és alja külön Kimeneti csonkoknál megelőzni a gőz bejutását Szűrőintegritás ellenőrzése sterilizálás után

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK 1. Bakteriális „challenge” teszt Szűrőelemek tényleges baktériumszűrő hatékonyságának vizsgálata (destruktív teszt) Pl.: 0,2 µm-es szűrő tesztelése ismert méretű sejteket tartalmazó Pseudomonas diminuta baktérium szuszpenzióval (min db sejt/cm 2 szűrőfelület) Tönkreteszi a szűrőt, ezért termelési körülmények között NEM alkalmazható Korreláltatható nem destruktív tesztekkel (átáramoltatásos, nyomástartási és buborékpont) 34

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK 2. Átáramoltatásos (Forward Flow) teszt Nedvesített szűrő és konstans levegőnyomás alkalmazása mellett mérjük a nedvesített membránon keresztül diffundált levegőáramot (ha adott max. érték alatt, akkor elfogadható) Downstream: Adott bemenő nyomás állandó értéken tartásához szükséges bemenő gázáram mérése Szűrő sterilizálása előtt/ steril szűrés után (áramlásmérő downstream oldalon) Upstream: Adott nyomás mellett az elmenő oldalon átdiffundált gáz mennyiségének mérése Sterilizálás előtt és után is 35

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK 3. Nyomástartási (Pressure Hold) teszt Az upstream átáramoltasásos teszt egyik módosított változata Nedvesített szűrő és szelepekkel lezárt szűrőház Gáznyomáscsökkenésének mérése adott idő alatt, állandó szűrőelem- és gázhőmérséklet mellett Alkalmazható Sterilezés után Szűrés előtt/után 36

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK 4. Buborékpont (Bubble Point) teszt Vizuális teszt Nedvesített szűrő Levegő átnyomása a szűrőn növekvő nyomással, miközben az elmenő oldali buborékolást vizsgáljuk Buborékolás: Diffúziós levegőátvitelkor: lassú, szemmel követhető Buborékpont után: folyamatos 37

SZŰRŐELEM INTEGRITÁS TESZTEK 5. Vízelárasztási (Water Intrusion) teszt Nedvesített szűrő Hidrofil membránnál alkohol oldattal, de ez termelési körülmények közt nem mindig alkalmazható Hidrofób szűrőelemeknél vízelárasztási teszt Szűrőház bemenő oldali vízelárasztása nyomás növelése mellett milyen nyomásnál kezd el folyni az elmenő oldalon a víz? 38

KÉRDÉSEK Mi a felületi, ill. mélységi szűrés ? Sorolj fel szűrőtípusokat! Jellemezd a polipropilén mélységi szűrőbetétet! Hol használnak koaleszcens szűrőket? Milyen dowstream műveleteknél alkalmaznak szűrőelemeket és mire? Jellemezd a szűrőintegritás teszteket néhány mondattal!

KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!