SDS-PAGE Kísérleti protokoll

Címkézzen meg 1,5 ml-es zárható tetejű mikrocsöveket a halminták neveivel. 1. Minta előkészítés

Mérjen ki 250µl Laemmli minta puffert minden egyes címkézett csőbe. 1. Minta előkészítés

Fehérje kivonás 2.1Minden mintához készítsen elő egy darab halizmot (1g), és tegye bele a címkézett mikrocsövekbe.

Rázza fel a cső tartalmát, majd 5 percig szobahőmérsékleten inkubálja a mintákat. 2. Fehérje kivonás

Fehérje kivonás 2.3Címkézett, csavaros tetejű csőbe öntsön le 18µl-t a pufferből, ami tartalmazza a kivont fehérjéket. Ne pipettázza át a haldarabot!

°C 2. Fehérje kivonás 2.4Melegítse 5 percig 95°C-on a hal, illetve aktin és miozin mintákat.

Az elektroforézis gél előkészítése 3.1Vágja végig a vonal mentén és vegye ki a gél kazettát.

Az elektroforézis gél előkészítése 3.2 A vonal mentén borotvapengével vagy szikével vágja fel a gél kazetta ragasztószalagját, és távolítsa el alsó szalagot.

Az elektroforézis kamra előkészítése 4.1 Rakja a gél kazettát a rövidebb végével befelé fordítva az elektród-kamrába. Rakjon egy másik gél kazettát vagy egy vak kazettát a kamra másik oldalára is. 4.2Nyomja le az elektród állványt, miközben bezárja a szorítókeret két karját. 4.3Eressze le a belső kamrát a mini tankba.

A kamra megtöltése pufferrel 5.1Töltse meg a belső kamrát 140 ml TGS elektroforézis pufferrel. 5.2Töltse meg a mini tankot 200 ml TGS elektroforézis pufferrel.

A gél feltöltése - A jobb és a bal nyílás üresen marad. - A maradékot töltse meg a következőkkel: - 10 µl Kaleidoszkóp standard (KS) - 10 µl aktin és miozin standard (AM) µl minta (Ügyeljen a protokoll sorrendjére!) -- P1 P2 P3 P4 P5 AM KS --

Az elektroforézis végrehajtása Zárja be a gél kamrákat és kezdje meg a gélelektroforézist 200V-on Állítsa le a folyamatot, amikor a Bróm-fenol kék eléri a gél alacsonyabb végét. ( ez kb. 25 percet vesz igénybe.)

A gél kivétele 8.1 Távolítsa el a szorító keretet és öntse bele a puffert a konténerbe. A puffer újrahasznosítható! 8.2 Vegye ki a gél kazettát, majd fektesse le a rövidebb felével fölfelé.

A gél kivétele 8.3A gél kazetta oldalai mentén vágja el a ragasztószalagot.

Távolítsa el a gél tabletta tetejét, az alját rajta a géllel tegye bele egy vízzel teli színező tálkába. 9.2A víz alatt válassza szét a gélt a tablettától. 9.3Cserélje ki a vizet 70 ml Coomassie-oldattal, és színezze 1 órán keresztül. 9. A gél színezése

A gél újraszínezése 10.1 Egy óra elteltével öntse le a színező oldatot Folyó víz alatt színezze át a gélt. (addig amíg a gél hátulja színtelen nem lesz).

A gél vizsgálata 11.1Állapítsa meg az izomfehérjékbeli különbségeket az egyes fajtákban. 11.2Kalibrációs görbe használatával határozza meg a két fehérje molekuláris súlyát.