Sejttani vizsgálatok. Morfológiai vizsgálatok 1.Fénymikroszkóp.

Az előadások a következő témára: "Sejttani vizsgálatok. Morfológiai vizsgálatok 1.Fénymikroszkóp."— Előadás másolata:

1 Sejttani vizsgálatok

2 Morfológiai vizsgálatok 1.Fénymikroszkóp

3 Kontrasztosítás A kondenzorrekesz erős szűkítése és/vagy a kondenzor süllyesztése Fáziskontraszt mikroszkóppal A fáziskontraszt berendezés egy speciális kondenzorból és ún. Fáziskontraszt objektívelből áll. Emberi gliasejt normál és fk mikroszkóppal

4 Fluoreszcens mikroszkópia Bizonyos anyagok meghatározott hullámhosszú fénnyel megvilágítva hosszabb hullámhosszú fényt bocsátanak ki a, szövetben eleve van ilyen anyag pl.: karotinoid, klorofill...) b, beviszünk ilyen anyagot a sejtbe Pl: fehérjékhez kötjük őket Nagyon érzékeny módszer

5 Elektromikroszkóp A minta megvilágítására felhasznált sugárforrás egy nagy energiájú (10–30 kV) elektron nyaláb Az elektronmikroszkópban elektromágnesekkel terelhetjük, fókuszálhatjuk és teríthetjük az elektron nyalábot Előnye : a megvilágító sugárzás hullámhosszának a fele a látható legkisebb részlet. Ez 200 nm körül van a látható fény esetében, itt jóval kisebb. Elektronmikroszkóppal, még sokkal tökéletlenebb lencsék esetén is sokkal apróbb részletek figyelhetők meg. Szemben az optikai mikroszkópok általában maximális 1000–1500 X nagyítást elérő felbontásával, elektronmikroszkóppal könnyen elérhető akár több 100 000 X nagyítás is.

6

7 Pásztázó elektromikroszkóp (televíziós elv) Adott tárgyat vékony pásztázó sugárral soronként képpontokra bontunk Egyidejűleg időben változó elektromos jellé alakítjuk Egy leképező monitorban pásztázással ismét összefüggő képpé alakítjuk Pásztázott terület kicsi, a monitor sokkal nagyobb

8 Preparátum készítés el. mikroszkóphoz Fémgőzölés (árnyékolás). A fémgőzölés egyenetlen felszínek, izolált makromolekulák vizsgálatára alkalmas. A vizsgálati anyagot zárt térben, vákuumban elpárologtatott nehézfémmel (pl. platinával) vonják be. A fémgőzölés történhet egy meghatározott irányból (szögárnyékolás) így a felszín egyes részei „árnyékban maradhatnak”: nem rakódnak le rájuk fémszemcsék. A fémréteget szilárdító karbonfilmmel vonják be, majd a biológiai mintát speciális oldószerrel eltávolítják alóla. Az elektronmikroszkópban a karbonrétegből és platinabevonatból álló replika vizsgálata történik.

9 Fagyasztva törés/maratás. Ha a vizsgálandó sejteket folyékony nitrogénben –196 °C-on hirtelen megfagyasztják, a víz apró kristályok formájában fagy meg, a sejten belüli struktúrák kevéssé károsodnak. A megfagyott blokkot mikrotomkéssel ketté lehet „pattintani” (fagyasztva törés [angol kifejezéssel freeze-fracture]). A törés síkja általában a membránfelszíneknél, gyakran egy hártya két lipidrétege között halad. A preparátumról fémgőzöléses replika készíthető a törési felszín vizsgálatára: a kettéhasított membránok transzmembránfehérjéi ilyenkor az egyik felszínen intramembrán partikulumokként jelennek meg. Ha a replika elkészítése előtt vákuumban a jeget szublimáltatják a törési felszínről, a kimaródott felszínről készült replika a sejtorganellumok felszínéről, topográfiai viszonyairól ad térhatású kép formájában információt (az eljárás neve: fagyasztva maratás [angolul freeze-etch]).

10

11

12 Nagyságrendi skála

13 Molekulák nyomon követése a sejtben I. Radioaktív izotópok alkalmazása a sejtbiológiában Az izotópok ugyanazon elemnek különböző tömegszámú variánsai: bennük a protonok (és elektronok) száma azonos, a neutronok számában azonban különböznek. Az azonos rendszám azonos kémiai viselkedést jelent, a sejt ezért ugyanazon elem különböző izotópjai között nem tud különbséget tenni, egyformán építi be őket molekuláiba. A radioaktív izotópok (radioizotópok) instabil atommaggal rendelkeznek: véletlenszerű elbomlásuk radioaktív sugárzást eredményez (pl. β-sugárzást [elektronokat], γ-sugárzást), amely megfelelő műszerrel érzékelhető.

14 Autoradiográfia A fény- és elektronmikroszkópos autoradiográfia alkalmas lágy β-sugárzó izotóppal (pl. 3 H-mal) jelölt prekurzor molekulák sejten belüli detektálására. Az in vivo vagy sejtkultúrában végrehajtott jelölés után a vizsgálati anyagból mikroszkópos preparátumot készítenek, a metszetet vékony fotoemulziós réteggel vonják be, majd megfelelő ideig expozíciót végeznek. A vizsgált sejtekbe beépült radioaktív prekurzor molekulákból származó elektronok az ezüstbromid kristályokban fotokémiai reakciót idéznek elő. Ezek előhívás után fekete ezüstszemcsék (angol kifejezéssel grainek) formájában jelölik a metszet felett a radioaktívvá vált régiókat. Az autoradiográfiával sokféle makromolekula szintézise vizsgálható: jelölt timidinnel például a DNS-replikáció, uridinnel az RNS-szintézis, aminosavakkal a fehérjeszintézis, monoszacharidokkal a fehérjeglikoziláció folyamata tanulmányozható.

15 A szekréciós út vizsgálata pulse-chase jelöléssel. (rövid, impulzusszerű jelölést (angolul pulse), majd izotóphigítást (chase) alkalmazni) Hasnyálmirigy mirigyvégkamra sejteket 3 percig jelölt aminosavval kezeltek (A), majd 7 (B), illetve 120 percig (C) jelöletlen aminosav jelenlétében folytatták az inkubációt. Az ezt követő elektronmikroszkópos autoradiográfia kimutatta, hogy a fehérjék az endoplazmatikus retikulumban képződnek, innen a Golgi-apparátusba kerülnek, majd szekréciós granulumok útján exocitózissal ürülnek ki a sejtből

16 Szeparációs módszerek 1. Centrifugálás A nehézségi gyorsulás (g) sokszorosának kitett sejtorganellum- szuszpenzióban vagy makromolekula-oldatokban a diszpergált részecskék méretüktől, alakjuktól és sűrűségüktől függően különböző mértékben ülepednek. A centrifugákban ezt úgy érik el, hogy nagyteljesítményű motorral fémrotort forgatnak, melyben a centrifugacsövek rögzített helyzetben (szögrotor) vagy a centrifugálás alatt vízszintes pozíciót felvéve (kilendülő- poharas rotor) forognak. A legnagyobb teljesítményű ultracentrifugákban 600 000 × g gyorsulás is elérhető.

17 Differenciál centrifugálás A módszer célja az eukariota sejtek organellumainak izolálása, tisztítása: a sejtek frakcionálása. A vizsgált sejteket, szövetet először vizes közegben homogenizálják: a sejthártyát ozmotikus sokkal, ultrahanggal vagy más mechanikai behatással roncsolják. A homogenátumot ezután ismételt, mind nagyobb sebességű centrifugálással frakcionálják : először a sejtmagokat, azután a mitokondriumokat, majd az endoplazmatikus retikulum összetöredezéséből képződő vezikulákat (mikroszómákat), végül a szabad riboszómákat ülepítik ki. Az utolsó centrifugálással nyert felülúszó a sejt oldódó anyagait tartalmazó citoszól.

18 Differenciál centrifugálás. Differenciál centrifugálás során egymást követő centrifugálási lépéseket alkalmazunk. Az egymást követő centrifugálások rendre egyre nagyobb fordulatszámon zajlanak. Az első centrifugálásnál csak a legnagyobb tömegű, illetve legnagyobb sűrűségű sejtalkotók ülepednek ki az adott centrifugálási idő alatt. Az első lépésből származó felülúszót a második lépésben tovább centrifugáljuk, immár magasabb fordulatszámon. Ezt a sémát követve az egymást követő centrifugálásokban rendre az egyre kisebb tömegű, illetve kisebb sűrűségű sejtalkotókat ülepítjük ki.

19 Sűrűség-gradiens centrifugálás. Sűrűség-gradiens centrifugálás során valamilyen a biológiai mintával reakcióba nem lépő, nagy sűrűségű anyagból, például cézium-kloridból gradienst hozunk létre a centrifugacsőben. Az alacsonysűrűségű felszínre rétegezzük a mintát. A centrifugálás során minden komponens csak addig a térrészig ülepedik, amelynek sűrűségével a saját sűrűsége éppen megegyezik. Ekkor az adott komponensre nem hat eredő erő, így „lebegni” fog. Ezen az elven tehát az egyes komponensek elválaszthatók a méretüktől függetlenül, kizárólag a sűrűségük alapján.

20 2. Kromatográfia A kromatográfiás szeparálás során a szétválasztandó molekulák oldatát (a mozgó fázist) szilárd mátrixon (az álló fázison) bocsátják át; ha az oldott molekulák eltérő kölcsönhatást alakítanak ki a mátrixszal, szétválaszthatók egymástól. A szilárd fázistól függően a kromatográfia különböző technikákkal hajtható végre (pl. papír-, vékonyréteg- kromatográfia stb.); a biológiában leginkább az oszlopkromatográfia terjedt el. A mátrixot üveg- vagy műanyag oszlopba töltik, a mintát a tetejére rétegezik, majd az oszlop alsó végének kinyitásával kémcsövekbe frakciókat gyűjtenek. A mátrixra felülről elúciós oldatot töltenek: ezzel mossák át a mintát az oszlopon.

21 Ha a szétválasztandó molekulák eltérő sebességgel haladnak át az oszlopon, külön frakciókban foghatók fel. A frakciók vizsgálatával nyerhető grafikon a kromatogramm.

22 Gélszűrés (gélkromatográfia) A gélkromatográfiás oszlopok kisméretű, porózus gélszemcsékből állnak. A mátrixgyöngyök készülhetnek agarózból, poliakrilamidból, dextránból, ezek az anyagok térhálót alkotnak, meghatározott méretű pórusokat hoznak létre. Az oszlopra felvitt minta nagy molekulái kizáródnak a gélszemcsék pórusaiból és a szemcsék között gyorsan áthaladnak az oszlopon; a kis molekulák viszont behatolnak a szemcsék belsejébe is, nagyobb folyadéktérben oszlanak meg és ezért késve jelennek meg a kromatográfiás frakciókban. A gélek különböző pórusnagyságú szemcsékkel készíthetők, így a gélszűrés széles molekulasúly-tartományban alkalmas molekulák (pl. fehérjék) méret szerinti frakcionálására.

23 3. Elektroforézis Az elektroforetikus módszerek a fehérjék és nukleinsavak frakcionálásában mára minden egyéb szeparációs technikát felülmúltak érzékenységben, sokféleségben és népszerűségben. Lényegük, hogy vizes közegben létrehozott elektromos térben a töltéssel rendelkező molekulák elmozdulnak az ellentétes töltésű elektród felé és ha vándorlásuk iránya vagy sebessége különböző, egymástól fizikailag elválaszthatók. A szeparáció javítására különböző szilárd mátrixokat használnak (pl. papírt, speciális membránokat, keményítőt), molekuláris biológiai szempontból azonban a legfontosabbak a gélelektroforetikus módszerek: az agaróz és poliakrilamid gélelektroforézis.

24 Agaróz gélelektroforézis Az agaróz poliszacharid, melynek vizes szuszpenziója hevítés, majd lehűtés után géllé dermed. Az agarózláncok egymással hidrogénhidakkal kapcsolódva térhálót hoznak létre, melynek sűrűsége az agarózkoncentrációtól függ. Az agaróz géleket nukleinsavak frakcionálására használják, a futtatás vízszintes géllemezben történik. Elektroforézis során a gél szűrőhatást gyakorol: a pórusokon keresztül mozogva a nukleinsav-molekulák szétválnak, hiszen a kicsik gyorsabban, a nagyok lassabban vándorolnak. Az agaróz gélelektroforézis DNS-fragmentumok frakcionálásának is rutinmódszere