Előadást letölteni
Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon
KiadtaLóránd Orsós Megváltozta több, mint 9 éve
1
B SEJT DIFFERENCIÁCIÓ A CSONTVELŐBEN
2
V DJ TCGACGTTATAT AGCTGCAATATA Junctional Diversity TTTTT Germline-encoded nucleotides Palindromic (P) nucleotides - not in the germline Non-template (N) encoded nucleotides - not in the germline Creates an essentially random sequence between the V region, D region and J region in heavy chains and the V region and J region in light chains
3
How does somatic gene rearrangement (recombination) work? 1.How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of DNA? Combinatorial diversity 2.How do V region find J regions and why don’t they join to C regions? 12-23 rule 3.How does the DNA break and rejoin? Imprecisely, with the random removal and addition of nucleotides to generate sequence diversity Junctional diversity (P- and N- nucleotides, see above)
4
Gene rearrangement and the synthesis of cell-surface IgM in B cells SUMMARY
5
Coexpression of IgD and IgM is regulated by RNA processing. Hogyan fejeznek ki az érett B-sejtek sejt felszíni IgM és IgD receptorokat is?
6
Hogyan működik Sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán ALLÉL KIZÁRÁS Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódik A sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki ? Minden B-sejt azonos specificitású immonglobulint termel A nehéz és a könnyű lánc is 2 példányban van a csíravonalban (anyai és apai kromoszómán) Mégis csak egy B-sejt receptor (BCR) képződik The B-sejt monospecifikus antitestet termel Ez alapvető fontosságú a specifikus ellenanyag válasz szempontjából. A mechanizmus ami ezt biztosítja: Allélkizárás…Allelic exclusion
7
ÜGYES GENETIKAI BIZONYÍTÉK AZ ALLÉL KIZÁRÁSRA Az Ig allotípusok a B-sejtek felszínén fluoreszcens festékkel kimutathatók a/a b/b a/b Y B b Y B a Y B b Y Y B ab Y B a ÉS ALLOTÍPUS- a H-lánc C-régió polimorfizmusa (marker) H-lánc átrendeződés gátlása megakadályozza, hogy egy B-limfocitában kétféle specificitás alakuljon ki
8
AZ ALLÉL KIZÁRÁS SZÜKSÉGES A HATÉKONY KLONÁLIS SZELEKCIÓHOZ Minden utódsejtnek ugyanazzal a specificitással kell rendelkeznie, máskülönben az immunválasz hatásfoka romlik A H-lánc átrendeződés gátlása az osztódó utódsejtekben megakadályozza az új specifitások létrejöttét S. typhi Antibody S. typhi
9
Y Y YY A H-lánc átrendeződés gátlása biztosítja, hogy egy sejtben csak egyféle ellenanyag képződjön Az allél kizárás megakadályozza a nem kívánatos specifitású ellenanyagok képződését B Saját antigen pl. májsejt S. aureus Y Y Y Y Y B Y Y Y Y Y Y Y Anti S. aureus Ab Y Y Y Y Y Y Anti- májsejt Ab Egyféle Ag receptor/sejtHA egy sejtben kétféle Ag receptor lenne Y Y Y Y Y Y Y Anti S. aureus Ab Ezáltal megakadályozza a nem kívánatos auto-reaktív választ
10
Az allél kizárás szükséges a repertoire teljességének kialakulásához („lyuk” a készletben) Anti-agyi fehérje B-sejt kizárása – sajáttal szembeni tolerancia Y Y B B Sejtenként egy Ag specificitás S. aureus Anti-agyi fehérje Ig AND anti-S. Aureus Ig Y Y Y B B IF ha sejtenként két specificitás lenne Anti-agyi fehérje Ig B B Deléció Anergia OR Anti-S.Aureus B sejtek kizáróknak és hiányoznak a készletből BUT Y Y Y B B
11
1.Az Ig génszegmensek szomatikus átrendeződése ellenőrzött sorrendben, meghatározott program szerint megy végbe 2.Egy egyed különböző B-limfocitáiban a gén szegmensek kombinációja nagy számú, egymástól eltérő nehéz és könnyű lánc variábilis régiót eredményez 3.Egy adott egyed teljes B-sejt készlete eltérő módon átrendezett, eltérő variábilis régióval rendelkező B-limfocitából áll A B-SEJT KÉSZLET SOKFÉLE ANTIGÉN FELISMERÉSÉRE KÉPES 4. Egy B-sejt az allél kizárás eredményeként csak egyféle nehéz és egyféle könnyű láncot szintetizál ELKÖTELEZETTÉ VÁLIK EGY ADOTT ANTIGÉN KÖTŐ HELY KIALAKÍTÁSÁÉRT A CSONTVELŐBEN ZAJLÓ SZOMATIKUS GÉNÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE
12
Az allél kizárás lehetőséget ad a limfómák diagnózisára Egyetlen egyedi átrendeződéssel rendelkező sejt klonális osztódása alapján a vérben keringő vagy csontvelői tumor sejtek aránya meghatározható Felhasználható a kezelést követő reziduális tumor sejtek követésére
13
Diagnosis and monitoring of the treatment of childhood acute lymphocytic leukemia (C-ALL) The sequence of the framework regions are well conserved. Step 1: design primers that amplify these regions together with the hypervariable regions Step 2: sequence the PCR fragments to obtain spec. Sequence info on the actual tumor (monoclonal, majority of amplification product is tumor-derived Step 3: based on the sequence info, design tumor-specific PCR primers Step 4: quantitate gene expression by Q-PCR. Follow success of therapy and detect minimal residual disease much earlier then by flow cytometry
14
Minimális reziduális betegség (MRD) A gyermekkori akut limfoblasztos leukémia (ALL) heterogén betegség Eltérő prognózisú alcsoportok Személyre szabott kemoterápia kiválasztása Terápiára adott válasz Relapszus korai felismerése Csontvelőátültetés
15
Áramlási citometria: Áramlási citometria: - a leukémiás sejtek abberáns protein expresszióját detektálja - kvantitatív módszer, de mintaigényes Real-time kvantitatív PCR Real-time kvantitatív PCR - a PCR specifikussága és érzékenysége + abszolút kvantitálás - minimális mennyiségű minta szükséges Minimális reziduális betegség (MRD) - nyomonkövetésére használt módszerek
16
1.gDNS izolálás D1 és follow-up csontvelő mintákból 2.Multiplex PCR: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK (BIOMED2 primer-párok) 3.Szekvenálás: Páciens-specifikus szekvencia 4.Primertervezés, real-time kvantitatív PCR assay (QPCR) optimalizálása és karakterizálása 6. Follow-up csontvelő minták analízise, MRD kvantitálása (D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként) (D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként) MRD analízis real-time kvantitatív PCR-ral: Munkafázisok
17
II. Szekvencia meghatározása ABI Prism - 3100 Avant Genetic Analyzer, ABI Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit Result of IMGT junction analysis (http//imgt.cines.fr): IGH rearrangement of patient Q015
18
IG/TCR génátrendeződések monitorozása real-time kvantitatív PCR-rel VN1DN2J Konszenzus próba és reverz primer Általunk tervezett, páciens-specifikus forward primer BIOMED2 Concerted Action: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK
19
Relapszuskockázat megállapítása MRD alapján
20
Perifériás A B sejt fejlődés szakaszai Őssejt - HSCKorai pro-B sejtKésői pro-B sejt Kis pre-B sejtÉretlen B sejtérett B sejt Az egyes érési fázisokat sejtfelszíni markerek megjelenése (vagy eltűnése) jellemzi Csíravonal D H to J H V H to D H J H VHDHJHVHDHJH Nagy pre-B sejt Pre-receptor Y Receptor H+L CD19, CD10,RAG
21
B-cell development is dependent on bone marrow stromal cells
22
Termelt faktorok – CITOKINEK Kolónia stimuláló faktorok Növekedési faktorok Differenciációs faktorok 2. A sztróma sejtek citokineket termelnek B A CSONTVELŐI SZTRÓMA SEJTEK TÁPLÁLJÁK/SEGÍTIK A FEJLŐDŐ B- LIMFOCITÁKAT A citokinek és a közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások a differenciáció során változnak Sztróma sejt 1. Specifikus sejt-sejt kölcsönhatás a sztróma sejtek és a B-sejtek között Sejt-sejt kölcsönhatás
23
Korai pro-B c-Kit Receptor Tyrosine kináz Stem cell factor (SCF) Sejthez kötött növekedési faktor VLA-4 (Integrin) CLP A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak Sztróma sejt Sejt adhéziós molekulák VCAM-1 (Ig superfamily) EBF, E2A Pax5
24
Interleukin-7 receptor Sztróma sejt Késői pro-B Pre-B Interleukin-7 Növekedési faktor Korai pro-B VLA-4 (Integrin) VCAM-1 (Ig superfamily) A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak CD19, CD10,RAG és proliferáció DJ… VDJ átrendeződés
25
B sejt receptor Átmenetileg jelenik meg a membránban produktív V H D H J H C H átrendeződés után VpreB/ 5 – pót L-lánc, a membrán kifejeződéshez szükséges Ig & Ig jelátvivő molekulák CH H-lánc V H D H J H V-preB 5 A pre-B sejt receptor liganduma nem ismert Pre-
26
The pre B-cell receptor monitors the quality of heavy chain rearrangement Mutation in λ5– arrest at Pro-B cell stage SÚLYOS IMMUNDEFICIENCIA Productive µ-lánc átrendeződés ---pre-BCR RAG gének lekapcsolása µ-lánc átrendeződés leáll ALLELIC EXCLUSION Egyféle µ-lánc és specificitás
27
A pre-B sejt receptor stimulálásának következményei 1.Biztosítja az egyedi specificitást Nagy Pre-B Sztróma sejt Ismeretlen ligand 2. Kiváltja a belépést a sejtciklusba ALLÉL KIZÁRÁS 1. Gátolja a további H-lánc átrendeződést 2.A keretben leolvasható átrendeződést hordozó pre-B sejtek osztódását eredményezi
28
Proliferáció Y Éretlen B sejt L-lánc kifejeződés IgM a membránban IgM A pre-B sejt receptor stimulálása sejtosztódást vált ki Large pre-B Sok nagy pre-B sejt azonos pre-B receptorokkal Large pre-B Intracellular VDJC H chain V L -J L átrendeződés Osztódás leáll Pre-B receptor eltűnik Kis pre-B
30
A GÉNÁTRENDEZŐDÉS LEHETŐSÉGEI V-D-J 1.allél V-D-J 2.allél mRNS Fehérje receptor Átrendeződés gátlása V-J 1.allél V-J 2.allél V-J 1.allél V-J 2.allél Nem sikeres Sikeres mRNS fehérje Átrendeződés gátlása mRNS fehérje Átrendeződés gátlása
31
Nem-produktív L-lánc átrendeződés megoldható további átrendetődéssel
32
A multi-specificitással rendelkező éretlen B-sejtek a csontvelőben rekednek
33
Receptor editing
34
A monovalens saját antigéneket felismerő éretlen B sejtek anergiás állapotba kerülnek Rövid élettartam a periférián
35
szigorúan ellenőrzött 1.Az immunoglobulin gén szegmensek szigorúan ellenőrzött átrendeződése egy egyedi H- és L-lánc 2.Egy adott B-sejt elkötelezetté válik egy egyedi H- és L-lánc variábilis domén szintézisére, ami meghatározza a specificitást 3.Egy adott egyedben nagy B-sejt készlet (repertoire) alakul ki, ahol az egyes B-sejt klónok különböző H- és L-lánc variábilis doménekkel rendelkeznek 4.Ez a potenciális B-sejt készlet sokféle különböző antigén felismerésére képes 5.A naív éretlen B-sejtek azonos H- és L-lánc variábilis régiókkal rendelkező IgM és IgD felszíni immunoglobulint is kifejeznek A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS ÉS ALLÉL KIZÁRÁS EREDMÉNYE
Hasonló előadás
© 2024 SlidePlayer.hu Inc.
All rights reserved.