Gyakorlati képzés: Genetikai variációk igazolása PCR segítségével.

Az előadások a következő témára: "Gyakorlati képzés: Genetikai variációk igazolása PCR segítségével."— Előadás másolata:

1 Gyakorlati képzés: Genetikai variációk igazolása PCR segítségével

2 A PCR készítés alapelve 10`, 72 °C Befejezés 60``, 94 ° Denaturáció 40 kör 120``, 94°C Denaturáció 60``, 55°C Melegítés 120``, 72 °C Nyúlás

3 I. A DNS kinyerése

4 1. Előkészítés 1.1 Cimkézze fel a 2 csavaros tetejű tubust a következőkkel: - GMO mentes (- GMO) - ételminta (T) és a csoportja számával! 1.2 Pipettázzon ki 500 µl-t a homogenizált InstaGene- Matrix-ból minden csőbe! Mindkét tubusban azonos mennyiségű mintának kell lennie! felső réteg gyöngyök

5 2. DNS előkészítése „GMO mentes ételből” 2.1Mérjen ki 1 g-ot az igazoltan GMO- mentes ételből, és helyezze bele egy mozsárba! 2.2Adjon hozzán 5 ml desztillált vizet!

6 2.3 Kb. 5 percig homogenizálja a keveréket! 2.4 Ismételten adjon hozzá 5 ml H2Odeszt.-t és törögesse addig, amíg annyira egyenletes lesz, hogy fel tudja pipettázni a keveréket! 2. DNS előkészítése „GMO mentes ételből”

7 2.5 Pipettázzon 25 µl-t az étel keverékből a “-GMO” jelzéssel ellátott tubus folyadékjába! 2.6 Zárja le ismét a tubust, és rázza össze a tubus pöccintgetésével! A „+GMO DNS“-sel való szennyezettség elkerülése érdekében a „-GMO anyagot“ kell kinyerni először! A mozsarat és zúzót tisztítószerrel kell elmosni és desztillált vízzel leöblíteni!

8 3. DNS előkészítése ételmintából 3.1Mérjen ki 1 g-ot a vizsgálni kívánt étel- mintából (T) és helyezze a mozsárba! 3.2 Adjon hozzá 5 ml H2Odeszt.–t! Használjon kesztyűt!!!

9 3.3Homogenizála a mintát kb. 5 percig! 3.4Ismételten adjon hozzá 5 ml H2Odeszt.-t és törögesse addig,amíg annyira egyenletes lesz, hogy fel tudja pipettázni a keveréket! 3. DNS előkészítése ételmintából

10 3.5 Pipettázzon 25 µl-t az étel keverékből a “T” jelzéssel ellátott tubus folyadékjába! 3.6 Zárja le ismét a tubust, és rázza össze a tubus pöccintgetésével!

11 4. Az enzimek denaturálása 95°C-on 4.1Helyezze 95°C-os víz fürdőbe mindkét mintát 5 percig! 4.2Centrifugálja a mintákat 5 percig 13000 rpm-es értéken! 4.3Tegyen 50 µl-t a fölülúszóból két előzőleg megcímkézett tubusba!

12 Vigyázat: Csak a felső rétegből vegyen az InstaGene gyöngyök nélkül az élelmiszer ellenőrző DNS és élelmiszer teszt DNS eltávolítása során!

13 II. Előkészítés: PCR and electrophorézis csoportmunkában Kijelölésük alapján, minden csoport előkészíti a PCR és az elektrophorézis egy részét a többi csoport számára.

14 III. A PCR előkészítése és végrehajtása

15 1. A PCR tubusok előkészítése 1.1 Számozza meg a tubusait 1-6-ig! 1.2 Pipettázza a PCR-előkészítményeket a következő táblázat alapján! 1.3 Keverje össze a PCR-előkészítményeit fel- és lepipettázva őket! 1.4 Hűtse a PCR-előkészítményeket jégen a PCR kezdetéig!

16 NrMaster MixDNA 110 µl PMM10 µl -GMO food control DNA 210 µl GMM10 µl -GMO food control DNA 310 µl PMM10 µl Test food DNA (T) 410 µl GMM10 µl Test food DNA (T) 510 µl PMM10 µl +GMO control DNA 610 µl GMM10 µl +GMO control DNA

17 Végezze el a PCR-t a thermocycler hőmérsékleti programja alapján! Ügyeljen a mintái poziciójára a thermocycler-ben az összekeverés elkerülése végett!! Győződjön meg róla hogy a mintái jól le vannak zárva! 2. A PCR elkészítése Cycler- Program Overview of the tubes in the cycler

18 IV. A PCR termékek meghatározása electrophorézis alapján (Agaróz/PAGE) 1.Agaróz- vagy Poliacril-amid- gélelektrophorezis segítségével határozd meg a PCR terméket! 2. A jelzések alapján fesse meg a géleit és analizálja őket! Filling the gelslots